功能菌對曲霉型豆豉風味物質形成的影響

于華，劉亞君，梅小慶，趙佳麗，張紅，陳夢媛

(1.四川工業科技學院 食品學院，四川 德陽 618500；2.四川工業科技學院 電子信息與計算機工程學院，四川 德陽 618500)

豆豉是以黑豆或黃豆為原料，利用微生物發酵制成的一種具有獨特風味的中國民族特色的傳統發酵食品。近些年來，其保健功能引起了研究者及消費者的高度關注[1]。已有的研究結果表明，豆豉具有良好的抗氧化性、降血壓和抗糖尿病等功能特性[2]。同時，豆豉中風味物質的形成機制歷來備受關注，其風味來源主要是微生物在豆豉中生長分泌的各種酶，降解了豆中的蛋白質、淀粉等大分子物質，水解后的次級代謝產物之間又經過一系列復雜的生化反應，從而生成獨特的風味物質[3]。

豆豉中風味物質的研究，前期依靠人的感官對其進行評判，但由于人的主觀因素該方法最終被淘汰。隨著科技的發展出現了頂空固相微萃取-氣質聯用法和高效液相色譜法，更快速、方便、準確地測定食品中的風味物質[4]。豆豉中風味物質的分析主要為測定有機酸、揮發性物質和游離氨基酸。近年來對豆豉中揮發性物質和功能性物質的研究越來越多，但大多是對豆豉風味物質的簡單檢測，對于豆豉混菌發酵中各功能菌的相互作用影響風味以及豆豉中各風味物質貢獻作用的研究較少。

本文對傳統的米曲霉型制曲工藝進行改進，在人工接種米曲霉的基礎上，又添加了異常威克漢姆酵母、乳酸片球菌和產酸芽孢桿菌等功能菌，以及不同配比，最終分析各種功能菌和功能菌相互作用對米曲霉型豆豉風味物質的影響。本研究對今后米曲霉型豆豉制作工藝的改進、功能菌以及風味物質的確定有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

黃豆：購于超市，成都人民營養食品廠；米曲霉孢子：石家莊市鼎鑫釀造食品科學研究所；異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)和產酸芽孢桿菌(Bacillusacidiproducens)：學院實驗室提供。

試劑：甲醛、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、無水乙酸鈉、硫酸鎂、牛肉膏、亞鐵氰化鉀、硫酸鋅、氫氧化鈉、氯化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二銨、磷酸等，以上藥品均為分析純；琥珀酸、草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、丙酸、乙酸，以上藥品均為色譜純。

1.1.2 培養基

MRS培養基、YPD培養基。

1.1.3 儀器與設備

GZ-250-HS Ⅱ恒溫培養箱；SW-CJ-IFD潔凈工作臺；GR60DF立式自動壓力蒸汽滅菌鍋；BH200生物顯微鏡；CP214電子天平；DZKW-4電子恒溫水浴鍋；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱；Starter 2C實驗室pH計；78HW-1恒溫磁力攪拌器；超聲波清洗機；高效液相色譜儀；氣相色譜-質譜聯用儀；固相微萃取裝置(包括手柄、導向桿、85 μm CAR-PDMS萃取纖維頭)。

1.2 試驗方法

1.2.1 功能菌菌懸液的制備[5]

分別將實驗室保藏的異常威克漢姆酵母、乳酸片球菌和產酸芽孢桿菌在相應的MRS平板培養基或YPD平板培養基上活化。將活化菌株接種于相應的平板培養基上培養至對數后期，用無菌生理鹽水洗脫，使其濃度達到108CFU/mL，置于4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.2 豆豉制備[6]

浸豆：稱取6份黃豆，每份100.0 g，將黃豆洗凈，放入40 ℃的溫水中恒溫浸泡3.5 h(重量增加約2.1倍，豆粒脹起無皺紋)，放掉浸泡水，瀝干。

蒸豆：把浸泡后瀝干水分的大豆放至壓力鍋中，蓋好鍋蓋，121 ℃蒸30 min，大豆蒸熟。

前發酵：將蒸熟的大豆拿出鍋，冷卻，添加功能菌，拌勻，放于30 ℃培養箱中培養，大豆的厚度約為3 cm，發酵12 h后每9 h翻一次，使每顆大豆都松散、不結塊。

添加功能菌：第一份加入0.0300 g米曲霉，記為1號樣；第二份加入0.0300 g米曲霉和2 mL異常威克漢姆酵母菌懸液，記為2號樣；第三份加入0.0300 g米曲霉和2 mL乳酸片球菌菌懸液，記為3號樣；第四份加入0.0300 g米曲霉和2 mL產酸芽孢桿菌菌懸液，記為4號樣；第五份加入0.0300 g米曲霉、1 mL異常威克漢姆酵母菌懸液和1 mL乳酸片球菌菌懸液，記為5號樣；第六份加入0.0300 g米曲霉和3種菌的混合菌懸液2 mL，記為6號樣。

洗曲：用約50 ℃清水把豆豉成品表面的霉菌以及污物清洗干凈，清洗4～6次，注意不要破皮。

后發酵：將大豆瀝干(每份的質量大約為167 g，重量增加至干黃豆的1.67倍)，加入12.0 g食鹽，拌勻，壓實裝罐密封，在37 ℃培養箱中進行后發酵，每隔2天測定其總酸和氨基酸態氮含量。

干豆豉：豆豉后發酵完成后，將豆豉放入真空干燥箱35 ℃干燥12 h，即為成熟豆豉。

1.2.3 豆豉中總酸的測定[7]

準確稱取5.0000 g的豆豉用研缽磨碎，加適量的蒸餾水，浸泡3 h，轉移至100 mL容量瓶中并定容，搖勻，過濾，去其初濾液(20 mL左右)，取濾液20 mL于燒杯中，按GB/T 5009.39-2003中4.2.1.4從“置于200 mL燒杯中加入60 mL水……可計算總酸含量”依次操作。計算參照GB/T 5009.39-2003中4.4.5。

1.2.4 豆豉中氨基酸態氮的測定

取上述濾液20 mL于燒杯中，按GB/T 5009.39-2003中4.2.1.4自“置于200 mL燒杯中加入60 mL水……”起依次操作。同時做空白試驗，計算參照GB/T 5009.39-2003中4.2.1.5。

1.2.5 豆豉中有機酸的測定

1.2.5.1 樣品處理

準確稱取磨碎的2.5 g豆豉，研磨后轉入到100 mL離心管中，加入50 mL超純水，于超聲波清洗機中提取30 min，溫度為60 ℃，使有機酸充分浸出，冷卻后4000 r/min離心20 min，將上清液轉移到100 mL的容量瓶中，殘渣加入25 mL超純水再提取，合并上清液，加入2 mL的10.6%亞鐵氰化鉀溶液和2 mL的30%硫酸鋅溶液沉淀蛋白，用超純水定容至刻度，搖勻，靜置30 min。吸取上清液用0.45 μm濾膜過濾，濾液供HPLC檢測[8]。

1.2.5.2 色譜條件[9,10]

色譜柱：Agilent ZORBAX-SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測器：二極管陣列檢測器；流動相A為0.5%磷酸氫二銨，并用H3PO4調節pH為2.5，流動相B為甲醇，流動相A∶流動相B為95∶5；流速為0.400 mL/min；檢測波長為210 nm；進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃。

1.2.5.3 標準曲線繪制

準確稱取各有機酸標準品0.2000 g(或0.2 mL)以超純水溶解并定容至100 mL備用。分別吸取各標準混合母液，用超純水稀釋成0.500，0.200，0.100，0.020，0.010 mg/mL系列混合標準溶液。進樣檢測，分別測定不同標準品的出峰時間，及其不同濃度所對應的峰面積，與標準曲線對照定量計算。

1.2.5.4 樣品測定

各待測樣品處理后上機檢測，記錄數據，與標準曲線對照定量計算。

1.2.6 豆豉中揮發性風味物質的測定[11,12]

1.2.6.1 樣品處理

取3 g豆豉樣品磨碎，放入20 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl，蓋上密封墊和鋁帽，密閉后于磁力攪拌器上在50 ℃加熱平衡20 min后，將萃取頭插入瓶中，推出纖維頭，恒溫吸附30 min，然后縮回萃取纖維頭，插入氣相色譜進樣口解吸5 min。

1.2.6.2 色譜條件

色譜柱Rtx-5MS為非極性毛細管柱；載氣為He，流速1.0 mL/min，不分流進樣；程序升溫：柱初溫55 ℃保持1 min，升溫速率：6 ℃/min，終溫230 ℃保持5 min。電離方式：電子電離；電離能：70 eV；電壓：350 V；接口溫度：230 ℃；掃描范圍：35～400 u。

2 試驗結果與分析

2.1 功能菌對豆豉中總酸和氨基酸態氮合成的影響

2.1.1 功能菌對豆豉中總酸合成的影響

豆豉發酵的酸度會直接影響微生物的生長代謝及種類，對豆豉的品質好壞有一定的影響[13]。本試驗在后發酵期間每隔3 d分別在6個豆豉樣品中取樣，然后用電位滴定法測定不同樣品不同時期的總酸變化情況，見圖1。

圖1 總酸的變化趨勢圖Fig.1 Change trend chart of total acids’ content

由圖1可知，豆豉在發酵過程中總酸一直呈增長趨勢，前期較為迅速，后期緩慢，第7天后趨于穩定。發酵前期，營養物質豐富，微生物代謝較快，產生大量有機酸，總酸增長迅速；發酵后期，營養物質的消耗和有機酸的積累，發酵環境處于高酸性，低營養狀態，從而導致微生物代謝緩慢，總酸含量增長緩慢。總酸最終含量分別為：1號樣1.579 g/100 g，2號樣1.904 g/100 g，3號樣1.971 g/100 g，4號樣1.791 g/100 g，5號樣1.771 g/100 g，6號樣1.504 g/100 g。由此可以看出，異常威克漢姆酵母菌和乳酸片球菌對總酸的貢獻較大，其他菌體和混菌對總酸的促進作用不大。

2.1.2 功能菌對豆豉中氨基酸態氮合成的影響

在豆豉發酵過程中，氨基酸態氮含量可以反映蛋白質水解程度，其含量是反映豆豉是否成熟的重要指標，且氨基酸態氮是豆豉中主要鮮味作用的一種風味物質[14]。在每次測定總酸時，同時進行氨基酸態氮的測定，不同樣品不同時期的氨基酸態氮變化情況見圖2。

圖2 后發酵過程中氨基酸態氮的變化趨勢圖Fig.2 Change trend chart of amino acid nitrogen content in the post fermentation process

由圖2可知，豆豉在發酵過程中氨基酸態氮一直呈增長趨勢，前期較為迅速，后期緩慢，第7天后趨于穩定，和總酸的變化趨勢一樣。由2圖可知米曲霉型豆豉在制曲階段額外加入功能菌并沒有對后發酵時間造成影響，但是對豆豉中氨基酸態氮含量有一定的影響，最終含量分別為：1號樣1.712 g/100 g，2號樣1.900 g/100 g，3號樣1.610 g/100 g，4號樣1.470 g/100 g，5號樣1.550 g/100 g，6號樣1.326 g/100 g。由此可以看出，異常威克漢姆酵母菌對氨基酸態氮貢獻最大，其他菌體和混菌均對其有抑制作用。且總酸和氨基酸態氮含量最低的都是6號樣，可知并不是加入的功能菌種類越多，總酸、氨基酸態氮含量就越高，有可能是菌種之間相互影響，氨基酸轉換成了其他物質。

2.2 功能菌對豆豉中有機酸合成的影響

2.2.1 標品有機酸標準曲線的繪制

標品為酒石酸、蘋果酸、乳酸、冰乙酸、檸檬酸、草酸、甲酸、琥珀酸、丙酸9種有機酸，分別進行5個濃度梯度的有機酸混標檢測，梯度為0.010～0.500 mg/mL，其中各有機酸標品濃度為0.500 mg/mL(或0.500 mL/mL)的高效液相色譜圖見圖3，各有機酸標準曲線見表1。

圖3 有機酸混合標樣的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC of organic acid mixing standard samples

由圖3可以清晰地看到不同的時間段出現了9個峰，分別對應9種有機酸：草酸、酒石酸、蘋果酸、甲酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸。

表1 9種有機酸標品測定的線性相關性Table 1 The linear correlation of the determination of 9 organic acid standard samples

將濃度在0.01～0.500 mg/mL(mL/mL)范圍內的系列混標溶液進行HPLC分析，對各測得值進行相關系數分析和線性回歸分析。結果表明：除乙酸的相關系數(R2)為0.929之外，其余的都大于0.990，說明各種有機酸組分的峰面積和有機酸組分濃度的線性相關性總體上很好，在誤差允許范圍內可以很好地測定有機酸的含量。

2.2.2 6個樣品中有機酸測定的結果

6個樣品中有機酸測定的結果見表2。

表2 6個樣品中有機酸的比較Table 2 The comparison of organic acids’ content in 6 samples

由表2可知，總體上各功能菌對米曲霉型豆豉混菌發酵產生有機酸貢獻不大，其中只有3號樣的有機酸種類最多，與1號樣相比，種類上多了一種甲酸；檸檬酸增加了約8.6倍；琥珀酸增加了約23.5倍，并且HPLC色譜圖中還有12個峰的保留時間與標品不一致。2號樣雖然與1號樣的有機酸種類一樣，但除酒石酸、蘋果酸、琥珀酸之外，其余的有機酸含量均有所下降。4，5號樣中有機酸的種類和含量都較少，6號樣沒有檢測出標品有機酸。所以，3種功能菌中只有乳酸片球菌對米曲霉型豆豉混菌發酵產生有機酸的貢獻最大。

2.3 功能菌對豆豉揮發性物質合成的影響

豆豉樣品中揮發性風味物質檢測結果見表3和表4。

表3 豆豉中揮發性風味成分含量Table 3 The content of volatile flavor components in fermented blank beans

續 表

表4 豆豉樣品中揮發性物質種類的比較Table 4 The comparison of volatile substances’ types in fermented blank beans samples

由表3和表4可知，6個豆豉樣品中檢測出了8類揮發性物質，分別為芳香烴類、醇類、酚類、呋喃、吡嗪、酮類、酸類和烷烯烴類，共23種風味物質。共同含有的物質有：苯甲醛、2,3-丁二醇、2,3,5-三甲基吡嗪、乙酸4種物質。檢測出的成分中沒有酯類，可能是因為干燥時間過長，并且沒有在真空干燥箱中進行，使酯類物質揮發。2號樣中的揮發性物質種類最多，共有16種，與1號樣相比，雖然吡嗪類種類較少，但醇類豐富，醇類的相對含量高達35%，所以異常威克漢姆酵母在醇類風味物質的形成過程中貢獻最大。3，4，5，6號樣中檢測出的揮發性風味物質的種類都少于1號樣，但是這4個樣中都含有2,3-丁二酮和乙偶姻，1，2號樣中均不含這兩種酮。所以乳酸片球菌、產酸芽孢桿菌和多種功能菌共同作用在豆豉酮類風味物質的形成過程中都有一定的貢獻作用。但綜合分析產酸芽孢桿菌和不同功能菌的組合對豆豉總酸、氨基酸態氮、有機酸和揮發性風味物質的形成沒有促進作用。

3 結論

本試驗采用傳統的米曲霉型豆豉發酵工藝在制曲階段分別加入了不同種功能菌，進行混菌發酵，并對其總酸、氨基酸態氮、揮發性物質及有機酸等風味物質進行測定。結果顯示：異常威克漢姆酵母對豆豉中氨基酸態氮的形成有較大的促進作用，含量為1.900 g/100 g。并且在有機酸、醇類風味物質的形成過程中貢獻最大，形成了異戊醇、5-甲基-3-庚醇、5-甲基-2-環己醇、2,3-丁烯-2-醇等獨特風味物質，醇類的相對含量高達35%。乳酸片球菌對豆豉中總酸的形成有較大的促進作用，含量為1.971 g/100 g，在酮類和有機酸風味物質的形成過程中貢獻最大，生成2,3-丁二酮和乙偶姻獨特風味物質，使檸檬酸增加了約8.6倍，琥珀酸增加了約23.5倍。產酸芽孢桿菌、異常威克漢姆酵母與乳酸片球菌混合以及3種功能菌混合作用對豆豉中總酸、氨基酸態氮和風味物質的貢獻都不明顯。此研究對于傳統曲霉發酵中接種功能菌對豆豉風味的影響奠定了基礎，對在工業上提升豆豉發酵工藝有重要意義。