玻璃化凍融卵裂期胚胎的保存時間對復蘇后結局的影響

冼卓杰，池霖生，黃建洲，朱 莉，李小琴

(佛山市婦幼保健院，廣東 佛山 528000)

1983年，Trounson和Mohry采用DMSO作為冷凍保護劑成功復蘇了一枚人類胚胎，并移植后獲得了妊娠。1999年～2005年，Kuwayama、Isachenko、El Danasouri、Lane等分別對人類卵母細胞、原核期胚胎、卵裂期胚胎和囊胚的玻璃化冷凍方法進行了成功的嘗試[1]，成為目前采用的各期配子和胚胎玻璃化冷凍方法的基礎。目前玻璃化凍融方式較程序化凍融胚胎復蘇率高[2]，但玻璃化冷凍實際中的冷凍保護劑二甲基亞砜(DMSO)對胚胎有一定的毒性，胚胎長期保存后其安全性仍需進一步研究。筆者對行激素替代周期(HRT)凍融卵裂期胚胎移植的947個周期的資料進行回顧性分析，探討冷凍胚胎保存時間對卵裂期胚胎的凍融復蘇效果的影響。現報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象：對2017年7月～2019年6月在我中心進行玻璃化凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)947個周期的資料進行回顧性分析，女方年齡20～44歲，平均(31.92±4.27)歲。入組標準：不孕原因為輸卵管因素或男性因素，且女方卵巢儲備功能正常，促排方案為長方案與超長方案所獲的玻璃化冷凍胚胎，解凍移植周期內膜準備采取HRT方案。排除因素：患子宮內膜異位癥與干擾胚胎著床疾病的患者；解凍胚胎移植周期失敗超過2次的患者。根據卵裂期胚胎冷凍保存時間分為四組，凍存≤120 d(294個周期)為≤120 d組，凍存121～240 d(384個周期)為121～240 d組，凍存241～365 d(105個周期)為241～365 d組，凍存>365 d為>365 d組(164個周期)。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2研究方法：促排方案為長方案和超長方案，方案的選擇，胚胎冷凍及解凍、胚胎移植等按照本中心的常規程序進行。胚胎玻璃化冷凍方法：冷凍試劑ES、VS室溫平衡30 min后，將D3胚胎置于ES中平衡6 min，待其形態恢復后，在VS中沖洗數次，胚胎裝入載桿，迅速投入液氮，胚胎在VS中的時間到投入液氮整個過程時間≤1 min。胚胎玻璃化解凍方法：解凍試劑包括WS1、WS2、WS3及WS4四種液體，提前30 min取出1 ml WS1倒入雙凹皿中并置于無CO2、37℃培養箱中預溫，其余三種液體分別置于室溫下四孔板中復溫。解凍時，快速將含胚胎載桿段浸入37℃的WS1中，輕晃使胚胎落下，37℃放置1 min，隨后依次在WS2平衡3 min、在WS3中平衡5 min、在WS4平衡1 min，最后將胚胎轉入6% CO2過夜平衡的G-2-PLUS培養液中進行胚胎評分后放置于37℃、6% CO2的培養箱中。移植前30 min將G-2-PLUS內的解凍胚胎轉移至EmbryoGlue中。[3]

1.3胚胎評分標準[3]：本中心主要根據卵裂球數目、均一性及碎片率進行評分。記錄卵裂球個數；均一性分3級(Ⅰ級：卵裂球大小均勻，形態規則；Ⅱ級：大小略不均勻，形態略不規則；Ⅲ級：大小明顯不均，可有明顯的形態不規則)；碎片分4級(Ⅰ級：無碎片或碎片數量<5%；Ⅱ級：碎片數量<20%；Ⅲ級：碎片數量為20%～50%；Ⅳ級：碎片數量>50%)。D3優質胚胎標準：D3胚胎細胞數為7～9個，細胞均一性為Ⅰ～Ⅱ級，碎片Ⅰ～Ⅱ級。

1.4HRT方案：月經第2～3天開始口服戊酸雌二醇4 mg，1次/d，口服5～7 d；月經第8～10天監測卵巢、子宮內膜厚度，增至口服戊酸雌二醇6 mg，1次/d，口服5～7 d。第13～15天監測子宮內膜厚度，如果內膜厚度<7 mm，雌激素以2 mg/d遞增，直至B超監測下子宮內膜≥7 mm后，血雌二醇>367 pmol/ml(100 pg/ml)、血P<3.12 nmol/ml時，給予黃體酮40～80 mg/d肌內注射。開始注射黃體酮當日為第1天，第4天行卵裂期胚胎復蘇移植術。胚胎移植后第14天查血HCG，確定是否妊娠。如陽性繼續用HCG或黃體酮至妊娠10～12周左右，胚胎移植28～35 d后行B超檢查，如妊娠囊中可探查到胎芽及搏動的胎心則為臨床妊娠。

2 結果

2.1一般資料：四組患者各組之間女方年齡、解凍胚胎個數和平均移植胚胎個數比較差異均無統計學意義(P>0.05)。>365 d組的女方年齡、解凍胚胎個數、平均移植胚胎個數均略高于其他三組。見表1。

表1 四組患者一般資料比較

2.2胚胎復蘇質量比較：四組患者的卵裂期胚胎冷凍后，≤120 d組的解凍復蘇率為97.64%，完整復蘇率為95.79%，均略高于其余三組，但差異并無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 四組患者胚胎解凍復蘇情況[例(%)]

2.3復蘇胚胎移植后臨床結局比較：四組患者解凍后移植的臨床妊娠率、流產率、異位妊娠率和種植率差異均無統計學意義(P>0.05)，但>365 d組的臨床妊娠率和種植率較低，≤120 d組與121～240 d組的流產率較高。見表3。

表3 四組患者解凍移植后的臨床結局(%)

3 討論

現在全世界范圍內的生殖中心廣泛采用胚胎和配子冷凍技術，使大量不育夫婦可以享受到天倫之樂。國內現在使用范圍最廣的冷凍方法當屬玻璃化冷凍法。玻璃化冷凍技術有著應用范圍廣、復蘇存活率高等優點，能夠有效保存優質胚胎，提高每個促排卵周期的累積妊娠率，減輕患者經濟與精神上的壓力[4-5]。

有研究[6]表明, 解凍后胚胎質量對妊娠的成功率起主要作用，而冷凍的胚胎質量直接影響著解凍后的臨床結局[7]。因此筆者回顧性分析了共947個凍融卵裂期胚胎解凍移植周期均通過長方案和超長方案進行促排，HRT方案進行解凍周期，盡量排除不同方案造成的差異。2010年Wirleitner B指出，胚胎冷凍時間的長短并不影響胚胎復蘇后的存活率、著床率、妊娠率[8]。2014年我國的一項回顧性分析[9]得出相同的觀點。本研究中四組的存活率、著床率和妊娠率之間差異無統計學意義(P>0.05)。Balaban B等指出,胚胎解凍后的復蘇情況對妊娠率有著顯著的影響[10]。本次研究中，>365 d組的解凍復蘇率、完整復蘇率和臨床妊娠率均為四組中最低，一定程度上驗證了前面的觀點，但差異無統計學意義(P>0.05)。

雖然目前的大樣本人群研究指出胚胎冷凍保存時間在6年內不會影響凍融胚胎的著床率、妊娠率及子代的出生缺陷率，但是今年來也有學者提出胚胎的冷凍保存可能會影響基因的穩定性，造成胚胎DNA碎片的增加、線粒體DNA的突變等[11]。盡管世界各地相繼報道了許多長時間冷凍后，成功妊娠并分娩健康嬰兒的案例，最長為冷凍胚胎保存了25年。但胚胎冷凍保存時間超過10年以上的活產均為個案報道，目前仍然缺乏大樣本的研究。長期胚胎冷凍保存時間對FET子代安全性的影響尚不明確[12]。

綜上所述，胚胎冷凍的時長不會影響凍融胚胎解凍的臨床結局。但長期冷凍保存的胚胎對子代安全性的影響尚不明確。