牛至精油成分分析及其抗氧化性和抑菌活性研究

李娜，武曉英*，趙文婧，翟飛紅，李曉君

(1.太原師范學院 生物系，山西 晉中 030619；2.中北大學 化學工程與技術學院，太原 030051)

牛至(OriganumvulgareL.)，又名滿坡香、蘑菇草、披薩草、五香草、小葉薄荷、花八角、野荊芥、止痢草、馬郁蘭、土香薷等，為唇形科牛至屬多年生草本或半灌木植物，在我國主要分布于河南、江蘇、浙江、安徽、江西、福建、湖北、湖南、陜西、甘肅、新疆等地區[1]。牛至是一種藥食同源植物，具有較高的藥用和食用價值。牛至全草都可入藥，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等作用，在生物農藥、殺蟲劑、抗氧化劑等天然產物[2,3]中的應用前景廣闊，同時，牛至常作為一種烹飪調味料使用，用于烘烤類的烹飪以及肉類的除腥提鮮等，是一種天然的調味品及香料。

牛至精油是從牛至莖葉中提取得到的淡黃色澄清油狀液體，揮發性很強，不易保存[4]，組成牛至精油的酚類化合物和萜烯類物質具有較強的抗菌和抗氧化活性[5]，評價牛至精油抗菌活性及殺菌效果的關鍵指標是香芹酚和百里香酚的含量和比例[6,7]。牛至精油中的主要抗氧化活性成分是酚酸類和萜類化合物[8,9]。酚酸類化合物苯環上的酚羥基是一種抗氧化活性基團，脫氫產生的苯氧自由基的穩定性與其清除自由基活性密切相關[10]。萜類化合物具有異戊二烯骨架并含有多個烯鍵，其化學性質活潑，并具有較強的還原性，可保護細胞膜和線粒體中的不飽和脂肪酸免受氧化，并保持膜的功能和完整性[11]。此外，牛至精油還具有毒性低、使用安全、成本低和經濟效益高的優點[12]，因此，牛至精油已廣泛應用于水果和蔬菜等食品的保鮮防腐領域。

目前關于香辛料的研究報道較多，尤其是對香辛料精油的研究更為廣泛，如八角茴香精油、花椒精油、肉桂精油等[13-16]。而對牛至這種調味品的研究相對較少，尤其對牛至精油成分的分析缺乏系統的總結和探討。因此，本文采用水蒸氣蒸餾法提取牛至精油，并利用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術分析牛至精油的組成成分。以BHT(2,6-二叔丁基對甲酚)作為對照，對牛至精油清除DPPH和ABTS自由基能力進行測定，初步探究牛至精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力，為牛至精油的綜合開發利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛至：購自亳州仙養御膳藥業有限公司；正己烷(色譜純)：Aladdin試劑公司；DPPH(分析純)、ABTS(分析純)：國藥集團化學試劑有限公司；所有其他有機溶劑均為國產分析純。

供試菌株：大腸桿菌(EscherichiacoilCGMCC 44568)、金黃色葡萄球菌(StaphylococusaureusCGMCC 26085)均購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

氣相色譜-質譜聯用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛至精油提取

采用水蒸氣蒸餾法提取牛至精油：將干燥牛至粉碎，過80目篩，置于圓底燒瓶中，以料液比1∶10加入蒸餾水，100 ℃進行提取，至無油狀物餾出為止。

1.2.2 精油提取率測定

采用—定質量的牛至粉碎物提取所得精油的質量來計算精油提取率；按公式(1)計算：

(1)

1.2.3 牛至精油組成成分GC-MS檢測

采用Trace 1300系列氣相色譜與ISQ單四極桿質譜檢測器(Thermo Fisher Scientific，USA)相連，與氣相色譜連接的柱子為TR-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。檢測升溫程序：55 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到250 ℃，保持5 min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度280 ℃；載氣為氦氣，流速1 mL/min。精油處理后以色譜純正己烷稀釋，進樣量1 μL，分流比5∶1。質譜條件：電離能量為70 eV的電子轟擊源，電子電離質譜范圍在33～550 m/z。

1.2.4 牛至精油抗氧化性測定

1.2.4.1 DPPH 自由基清除能力測定

取0.3 mL不同濃度的牛至精油樣品于試管中，分別加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液，室溫下在黑暗中反應30 min，在518 nm處測量吸光度值。以無水甲醇為空白參照，以BHT作為陽性對照。根據公式(2)計算DPPH自由基清除率，并計算半數抑制率IC50值。

(2)

式中：I為牛至精油對DPPH·的清除率；A0為DPPH·空白對照的吸光度值；As為樣品與DPPH·反應后的吸光度值。

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力測定

將7 mol/mL的ABTS和2.5 mol/mL的過硫酸鉀溶液在室溫下以等體積混合，并在黑暗中反應12～16 h以獲得ABTS+·工作液。然后將獲得的ABTS+·工作液用80%乙醇稀釋，使其OD值在734 nm的條件下測得為0.7，備用。取0.3 mL不同濃度的牛至精油樣品于試管中，加入2.7 mL ABTS+·工作液，混勻，暗反應30 min，以無水乙醇為空白參照，以BHT為陽性對照，在734 nm處依次測量吸光度值，根據公式(3)計算ABTS自由基清除率，并計算出半數抑制率IC50值。

(3)

式中：I為牛至精油對ABTS+·的清除率；A0為ABTS+·空白對照的吸光度值；As為樣品與ABTS+·反應后的吸光度值。

1.2.5 牛至精油抗菌活性研究

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌置于37 ℃恒溫振蕩培養箱中培養至對數生長期，然后用無菌水將活化的菌種稀釋，配制細菌懸浮液，使細菌懸浮液中含有約106CFU/mL的細菌數量。移取100 μL不同供試菌種的細菌懸浮液均勻涂布在LB固體培養基上制成含菌平板。將3個已滅菌的圓形濾紙片(6 mm) 等距放置在每個含菌平板上，其中一個滴加5 μL蒸餾水作為空白對照，向另外兩個中滴加5 μL牛至精油，把含菌平板置于37 ℃的恒溫箱中培養24 h。測定抑菌圈直徑，每個菌種重復3次。

2 結果與分析

2.1 牛至精油的提取率

采用水蒸氣蒸餾法提取牛至精油，約需4 h，不再有精油餾出，即完成提取。平均提取率為0.15%，通過水蒸氣蒸餾法獲得的精油是淡黃色透明油狀液體，具有濃烈的香氣。

2.2 牛至精油氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析

牛至精油揮發性成分總離子流圖見圖1。

圖1 牛至精油揮發性成分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds of essential oils from oregano

實驗共檢測出54種精油組成成分。利用峰面積歸一化法并與NIST數據庫對比及查閱相關文獻資料，列出各組分及其相對含量，結果見表1。

表1 牛至精油化學成分Table 1 Chemical constituents of essential oils from oregano

續 表

由表1可知，分析出54種相對含量為0.1%以上的化合物，占精油總含量的91.04%，其中，牛至精油的主要成分是酚類和萜烯類化合物。有4種相對百分含量較高的化合物成分，分別是百里香酚(26.63%)、香芹酚(14.44%)、2-異丙基-1-甲氧基-4-甲基苯(11.75%)和松油烯(9.23%)。牛至精油的組成成分受客觀因素的影響較大，如氣候、土壤以及收獲時間等，因此，本研究結果與文獻[17-20]報道的有所不同，但也有多種共有成分，如α-蒎烯、檸檬烯、百里香酚、香芹酚、松油烯、石竹烯、法尼烯等。

圖2 化合物質譜對比圖及其結構式Fig.2 Comparison of mass spectra of compounds and their chemical structures

2.3 牛至精油的抗氧化性

2.3.1 牛至精油清除DPPH自由基能力

DPPH·是一種穩定的有機基團，DPPH 溶液在518 nm波長處有很強的吸收峰，具有特征性顏色紫色。當加入抗氧化物質時，來自抗氧化劑的1個電子與穩定的DPPH·電子配對，因此，DPPH的特征紫色變淡，抗氧化劑的濃度越高，DPPH溶液的顏色越淺，因此可根據加入抗氧化劑前后DPPH溶液吸光度值的變化來確定物質的抗氧化能力。牛至精油和BHT對DPPH自由基的清除能力結果見圖3。

由圖3可知，在實驗濃度范圍內，隨著牛至精油和BHT濃度的增加，二者對DPPH自由基的清除能力都呈現對數增長趨勢，其半數抑制率IC50值分別為1.41 μg/mL和4.10 μg/mL。可見，牛至精油清除DPPH 自由基的能力優于化學合成的抗氧化劑BHT，即牛至精油具有更強的抗氧化性。

圖3 牛至精油(A)和BHT (B)對DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging capacity of oregano essential oils (A) and BHT (B) to DPPH·

2.3.2 牛至精油清除ABTS自由基的能力測定

ABTS在合適的氧化劑作用下被氧化成綠色的ABTS+·，并在抗氧化物存在時抑制ABTS+·的產生，使得綠色變淡，因此在734 nm處測量加入抗氧化物質前后ABTS+·的吸光度值變化，可以計算出樣品的總抗氧化能力。牛至精油和BHT對ABTS自由基的清除能力結果見圖4。

圖4 牛至精油(A)和BHT(B)對ABTS+·的清除能力Fig.4 The scavenging capacity of oregano essential oils (A) and BHT (B) to ABTS+·

由圖4可知，在測量范圍內，隨著牛至精油和BHT濃度的增加，二者對ABTS+·的清除能力都呈現出對數增加，半數抑制率IC50分別為0.0103 μg/mL和1.3596 μg/mL。因此，牛至精油清除ABTS+·的能力顯著優于BHT，即牛至精油具有比化學合成的抗氧化劑BHT更強的抗氧化活性。

2.4 牛至精油的抑菌性

牛至精油對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌效果見圖5。

圖5 牛至精油對大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)的抑菌圈Fig.5 The inhibition zone of oregano essential oils against Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)

牛至精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為9.5 mm和6.5 mm，由此可以看出，同種精油對不同菌種具有不同的抑菌活性，在同等條件下，牛至精油對大腸桿菌的抑菌活性比對金黃色葡萄球菌的抑菌活性更強，牛至精油對大腸桿菌屬中敏感度，對金黃色葡萄球菌屬低敏感度，本結果與錢驊等[21]的研究結果一致，表明牛至精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用。

3 結論

本研究以天然植物牛至的次級代謝產物——牛至精油為研究對象，運用GC-MS技術分析了牛至精油的化學成分，并對其抗氧化性和抑菌性進行了初探。牛至精油主要含有酚類物質(如百里香酚、香芹酚等)及烯類物質(如松油烯、石竹烯、檸檬烯等)等，具有良好的抗氧化性和抗菌活性。牛至精油對DPPH自由基和ABTS自由基均有較強的清除能力，且清除能力都優于化學合成的抗氧化劑BHT。牛至精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有顯著的抑菌性，而且在同等條件下，牛至精油對大腸桿菌的抑菌活性比對金黃色葡萄球菌的抑菌活性更強。因此，牛至精油具有來源安全、效果好等優點。本研究為牛至精油在食品保鮮、農藥開發、動物免疫等方面的開發應用提供了一定的科學依據。