嗜酸乳桿菌和乳酸乳球菌單獨發酵對菊芋泡菜的影響

徐清萍，郭苗苗，唐百芬，唐培鑫，胡麗亞，孟君

(1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，鄭州 450001；2.食品生產與安全河南省協同創新中心，鄭州 450001)

泡菜應用歷史悠久，主要是對蔬菜進行發酵而制作，能夠較好地保留蔬菜中的營養成分，且微生物發酵過程中會產生一些對人體有益的代謝產物[1]。發酵分為人工發酵與自然發酵[2]，其中自然發酵主要是利用蔬菜自身微生物菌體來進行發酵，發酵周期較長，發酵結果不能人為控制，容易產生大量亞硝酸鹽等有害物質，且是利用不明菌體發酵，自身存在著一定的風險；人工發酵是利用微生物接種來進行的，主要是采用乳酸菌發酵乳酸來制作，可以快速制成含酸較高、亞硝酸鹽含量低的產品。

菊芋，又名洋姜、鬼子姜，為菊科向日葵屬宿根生草本植物。菊芋地上部分為莖葉和花，地下部分為根和塊莖，菊芋中含有菊糖、酚酸、甾體、萜類、黃酮等多種生物活性成分，具有控制血糖、免疫調節和抗腫瘤等多種作用[3]。菊芋塊莖可用于生產低聚果糖、菊糖，制成菊芋干、熬粥等，菊芋也常用于腌制泡菜、醬菜[4]。

本文主要以菊芋為原料，將具有抗菌活性的嗜酸乳桿菌LL、乳酸乳球菌LA分別單獨應用于泡菜發酵，研究發酵時間、發酵溫度、接種量、加糖量對嗜酸乳桿菌LL、乳酸乳球菌LA單獨發酵的影響，探討抗菌性乳酸菌發酵在泡菜生產中的應用，實現菊芋泡菜的安全生產。

1 材料和方法

1.1 材料

食鹽、白砂糖：食品級，市售；菊芋：鄭州附近種植地新鮮采收。

嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL：鄭州輕工業大學食品新產品新技術創新實驗室保藏。

大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7 ATCC43895)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC(B)26003)：上海魯微科技有限公司。

MRS培養基：杭州百思一基生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

SHP-250智能生化培養箱 上海鴻都電子科技有限公司；LX-C35L滅菌鍋 合肥華泰醫療設備有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；YP20001電子天平 上海光正醫療儀器有限公司；UV-5500分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 發酵菊芋的制備

1.3.1 工藝流程

新鮮菊芋→清洗→晾干→切片→加入輔料→混勻→接種→發酵→成品。

1.3.2 菊芋的發酵

配制番茄-黃豆芽-菊芋培養液[5,6]：稱取20 g番茄，20 g黃豆芽，10 g菊芋，加入1 L水煮30 min，過濾后加入20 g葡萄糖，攪拌溶解，補水定容至1 L，滅菌，冷卻后備用。

將嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL分別接入MRS肉湯培養基活化后，按接種量2%(體積分數)，分別轉接到番茄-黃豆芽-菊芋培養液中培養24 h，作為乳酸菌種液。

香辛料液：鹽80 g/L，高良姜10 g/L，生姜10 g/L，二荊條10 g/L，花椒1 g/L。

新鮮菊芋清洗、晾干、切片，按香辛料液∶菊芋為1∶1的比例倒入香辛料液，按比例加入白糖、食鹽，拌勻，接種乳酸菌種液。分別考察發酵溫度、接種量、加糖量、發酵時間等對發酵菊芋的影響。發酵期間定期取樣測定總酸含量(以乳酸計)、亞硝酸鹽、氨基酸態氮等指標。

1.3.3 總酸含量的測定

參考GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》。

1.3.4 亞硝酸鹽含量的測定

參考GB 5009.33-2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》。

1.3.5 氨基酸態氮含量的測定

參考GB 5009.235-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》。

1.3.6 抑菌性的測定

將大腸桿菌或金黃色葡萄球菌轉接至營養肉湯培養基，37 ℃培養16～18 h后，以10000 r/min離心15 min，生理鹽水洗滌，制備菌懸液，調整菌液濃度至106CFU/mL。將15 mL瓊脂(1.8%)培養基倒入滅過菌的培養皿中，靜置，凝固，作為下層。將冷卻至50 ℃左右的營養瓊脂培養基倒入已經凝固的下層平板上，作為上層。取0.2 mL大腸桿菌菌懸液(106CFU/mL)涂布平板，涂布均勻。將滅菌牛津杯(Φ7.8 mm)均勻放置在培養基上，使其與培養基無縫隙[7]。取200 μL待測液于牛津杯中，37 ℃培養16～18 h，觀察抑菌情況，采用游標卡尺測定抑菌圈直徑。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性

嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL為實驗室前期采用牛津杯法篩選出的具有抗菌活性的菌株。以大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7 ATCC43895)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC(B)26003)為檢驗菌，測定嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL對大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7 ATCC43895)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC(B)26003)的抑菌性，結果見表1。

表1 乳酸菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性Table 1 The antibacterial activity of Escherichia coli and Staphylococcus aureus

由表1可知，嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL對大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7 ATCC43895)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC(B)26003)具有抑菌性。

2.2 溫度對菊芋發酵的影響

按香辛料液∶菊芋為1∶1(質量比)的比例，將菊芋、香辛料液倒入泡菜壇中，加入白砂糖10 g/kg，分別接種嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL種液50 g/kg，將菊芋片分別在室外(5～15 ℃)、室溫(25 ℃)、30 ℃、34 ℃、37 ℃條件下發酵，發酵7，14 d時取樣測定發酵液中總酸(以乳酸計)含量、氨基酸態氮含量及菊芋片中亞硝酸鹽含量，結果見圖1～圖3。

2.2.1 不同溫度發酵菊芋時總酸含量變化

不同發酵溫度時菊芋發酵液總酸含量(以乳酸計)見圖1。

圖1 發酵溫度對菊芋發酵液總酸的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on total acids of Jerusalem artichoke fermentation broth

由圖1中(1)可知，采用嗜酸乳桿菌LA發酵，總酸含量(以乳酸計)在發酵溫度30 ℃以上時增長均較快，發酵7 d后總酸含量變化不大，其中在30～37 ℃，總酸含量均在12 g/L以上。由圖1中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL發酵時，室溫以上發酵時，總酸含量增加較快。在發酵溫度較低(室外15 ℃以下)時，嗜酸乳桿菌LL、乳酸乳球菌發酵液的總酸含量增長緩慢。結果表明，溫度在30～37 ℃，嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL生長產酸較快。

2.2.2 不同溫度發酵菊芋時亞硝酸鹽含量變化

采用嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL在不同發酵溫度時菊芋片中亞硝酸鹽含量見圖2。

圖2 發酵溫度對菊芋亞硝酸鹽含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on nitrite content of Jerusalem artichoke

由圖2中(1)可知，采用嗜酸乳桿菌LA發酵，菊芋片中亞硝酸鹽含量在發酵7 d時較高，發酵14 d時下降。對比不同發酵溫度時亞硝酸鹽含量，發酵7 d時，34 ℃發酵亞硝酸鹽含量最低。由圖2中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL發酵時，發酵7 d時室外低溫發酵亞硝酸鹽含量最高，發酵14 d時亞硝酸鹽含量降低或不再明顯變化。總體來說，采用乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌單獨發酵，亞硝酸鹽含量均符合國標限量要求，發酵14 d時亞硝酸鹽含量均低于5 mg/kg。

2.2.3 不同溫度發酵菊芋時發酵液中氨基酸態氮含量變化

分別采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL在不同溫度發酵菊芋時發酵液中氨基酸態氮含量見圖3。

圖3 發酵溫度對菊芋發酵液中氨基酸態氮含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on amino acid nitrogen content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由圖3中(1)可知，采用嗜酸乳桿菌LA發酵，發酵溫度低于37 ℃時，隨著時間延長，氨基酸態氮有所增加，37 ℃發酵時，在發酵7 d后，氨基酸態氮含量不再明顯改變。由圖3中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL發酵時，當發酵溫度高于室溫25 ℃時，隨著發酵時間延長，發酵液中氨基酸態氮含量增加，低于室溫(室外)發酵時，氨基酸態氮含量變化較小。其中，發酵溫度在34～37 ℃時，發酵液中氨基酸態氮含量增長較快。

對比不同溫度發酵時總酸含量(以乳酸計)、亞硝酸鹽含量、氨基酸態氮含量，采用嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL分別發酵，發酵溫度在30～37 ℃，發酵7 d時，總酸含量不再明顯增加。采用嗜酸乳桿菌LA發酵，亞硝酸鹽含量在發酵7 d時較高，在發酵14 d時，亞硝酸鹽含量降低至3.1 mg/kg以下；采用乳酸乳球菌LL高于室溫發酵，發酵7 d后，亞硝酸鹽含量基本不再明顯改變。其中，采用嗜酸乳桿菌LA發酵7 d，產酸較快且亞硝酸鹽含量較低的發酵溫度為34 ℃；采用乳酸乳球菌LL發酵7～14 d，產酸較快且亞硝酸鹽含量較低的發酵溫度為37 ℃。隨著發酵時間的延長，室溫發酵時，亦能達到比較理想的效果。

2.3 接種量對發酵的影響

按香辛料液∶菊芋為1∶1(質量比)的比例，將菊芋、香辛料液倒入泡菜壇中，加入糖10 g/kg,分別接種嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL，接種量分別為0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%、5%、10%、15%(質量分數)，34 ℃發酵7，14 d時取樣測定發酵液中總酸(以乳酸計)含量、菊芋片中亞硝酸鹽含量及氨基酸態氮含量，結果見圖4～圖6。

2.3.1 不同接種量對總酸含量的影響

接種量對嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL分別發酵菊芋時的影響見圖4。

圖4 接種量對菊芋發酵液總酸含量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on total acid content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由圖4中(1)可知，采用嗜酸乳桿菌LA發酵時，發酵7 d時，接種量在0.2%～10%(質量分數)時總酸含量均在12 g/L以上，各組間相差不大，其中接種量2%(質量分數)時總酸含量最大，為12.94 g/L。由圖4中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL發酵時，接種量在2%～15%(質量分數)時總酸含量較高，其中接種量10%(質量分數)時總酸含量最大，發酵7 d時為12.94 g/L。但對比不同接種量接種后發酵7 d時發酵液中總酸，基本在11～13 g/L間波動，相差不大。接種量主要影響總酸含量達到峰值的時間，隨著發酵時間的延長，各組間的差異變小。

2.3.2 不同接種量對亞硝酸鹽含量的影響

分別采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL發酵菊芋片中亞硝酸鹽含量見圖5。

圖5 接種量對菊芋亞硝酸鹽含量的影響Fig.5 Effect of inoculation amount on nitrite content of Jerusalem artichoke

由圖5可知，發酵7 d后，隨著發酵時間延長，總體來說，亞硝酸鹽含量呈下降趨勢或不再明顯變化。由圖5中(1)可知，采用嗜酸乳桿菌LA發酵，接種量為5%時，亞硝酸鹽含量最低。由圖5中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL發酵7～14 d時，接種量5%時亞硝酸鹽含量均較低。

2.3.3 不同接種量對氨基酸態氮的影響

分別采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL發酵菊芋，接種量對菊芋發酵液中氨基酸態氮含量的影響見圖6。

圖6 接種量對菊芋發酵液中氨基酸態氮含量的影響Fig.6 Effect of inoculation amount on amino acid nitrogen content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由圖6可知，隨著發酵時間延長，發酵液中氨基酸態氮含量增加，但在發酵7 d后，增長幅度不大。其中采用嗜酸乳桿菌LA(見圖6中(1))和乳酸乳球菌LL(見圖6中(2))分別單獨發酵，發酵7 d、接種量0.5%(質量分數)時氨基酸態氮含量最高；與乳酸乳球菌LL發酵相比，采用嗜酸乳桿菌LA發酵時，發酵液中氨基酸態氮含量要略高一些。

綜合考慮總酸含量、亞硝酸鹽含量，采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL分別發酵，均為接種量5%時產酸較快且亞硝酸鹽含量較低。

2.4 加糖量對發酵的影響

按香辛料液∶菊芋為1∶1(質量比)的比例，將菊芋、香辛料液倒入泡菜壇中，加白砂糖量0～25 g/kg，分別接種乳酸乳球菌LL、嗜酸乳桿菌LA 5%(質量分數)，34 ℃發酵7，14 d時取樣測定發酵液中總酸(以乳酸計)含量、菊芋片中亞硝酸鹽含量及氨基酸態氮含量，結果見圖7～圖9。

2.4.1 加糖量對總酸含量的影響

加糖量對分別采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL發酵菊芋后發酵液中總酸含量(以乳酸計)的影響見圖7。

圖7 加糖量對菊芋發酵液總酸含量的影響Fig.7 Effect of sugar content on lactic acid content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由圖7中(1)可知，采用嗜酸乳桿菌LA發酵，與發酵7 d相比，發酵14 d時總酸含量略有增加，但變化幅度不大；由圖7中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL發酵時，發酵7 d后，總酸含量無明顯增加，基本穩定。其中，采用嗜酸乳桿菌LA發酵時總酸含量要略高于采用乳酸乳球菌LL發酵。菊芋發酵過程中加入一定的糖主要是為了促進乳酸菌的增殖培養，由圖7可知，加糖量在0～25 g/kg時，隨著糖添加量的增加，總酸含量并無明顯增加，各組間總酸含量(以乳酸計)相差不大，說明加糖量控制在0～25 g/kg時，對成品的總酸含量影響不大，嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL對蔗糖利用及轉酸能力較弱。

2.4.2 加糖量對亞硝酸鹽含量的影響

不同加糖量時分別采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL發酵后，菊芋片中亞硝酸鹽含量見圖8。

圖8 加糖量對亞硝酸鹽含量的影響Fig.8 Effect of sugar content on nitrite content of Jerusalem artichoke

由圖8中(1)可知，采用嗜酸乳桿菌發酵，加糖量在0～10 g/kg時，發酵7 d時亞硝酸鹽含量較高，14 d時亞硝酸鹽含量下降，加糖量在15～25 g/kg時，亞硝酸鹽含量在14 d時略有增加，在發酵14 d時，糖含量較高時亞硝酸鹽含量也略高；其中，加糖量5 g/kg時，亞硝酸鹽含量在7～14 d時均較低。由圖8中(2)可知，采用乳酸乳球菌發酵，加糖量在5～10 g/kg時，亞硝酸鹽含量相對較低，發酵7 d后，多數情況下亞硝酸鹽含量隨時間延長略有下降，其中加糖量5 g/kg時，亞硝酸鹽含量最低。總體來說，采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL發酵，各組之間亞硝酸鹽含量相差不大，發酵7，14 d時菊芋片中亞硝酸鹽含量基本在2～4 mg/kg。

泡菜中亞硝酸鹽的形成主要與含有硝酸還原酶的細菌密切相關，大腸桿菌、摩根氏變形桿菌等有害雜菌都能加速亞硝酸鹽的形成[8]。泡菜中的革蘭氏陰性菌屬于硝酸鹽還原陽性菌。乳酸乳球菌LL和嗜酸乳桿菌LA除發酵產酸外，對大腸桿菌等具有一定的抑菌性，測定不同發酵溫度、不同接種量及不同加糖量各組中亞硝酸鹽含量，可知在25～34 ℃發酵時，發酵7 d，亞硝酸鹽含量低于7 mg/kg；發酵14 d，亞硝酸鹽含量低于5 mg/kg。根據食品安全國家標準GB 2762—2017《食品中污染物限量》，蔬菜及其蔬菜制品包括腌漬蔬菜中亞硝酸鹽含量(以NaNO2計)限量要求低于20 mg/kg。菊芋發酵后7 d，亞硝酸鹽含量符合國標要求，從食用安全性來看，適當延長發酵期更有利于亞硝酸鹽的清除。

2.4.3 加糖量對氨基酸態氮含量的影響

不同加糖量時，分別采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL發酵菊芋片后發酵液中氨基酸態氮含量見圖9。

圖9 不同加糖量對菊芋發酵液中氨基酸態氮含量的影響Fig.9 Effect of different sugar content on amino acid nitrogen content of Jerusalem artichoke fermentation broth

由圖9可知，發酵7 d后，隨著發酵時間延長，氨基酸態氮含量略有增長。由圖9中(1)可知，采用嗜酸乳桿菌LA發酵時，加糖量在10～20 g/kg時，氨基酸態氮含量較高。由圖9中(2)可知，采用乳酸乳球菌LL發酵時，各組間氨基酸態氮含量相差不大；且與采用乳酸乳球菌發酵相比，采用嗜酸乳桿菌發酵后，發酵液中氨基酸態氮含量更高。

發酵溫度、接種量、加糖量等因素主要影響發酵初期菌種的增殖期，是否能促進菌種快速增殖到所需數量，發酵總酸含量到達高峰的時間。其中，發酵溫度為30～37 ℃時更有利嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL的生長產酸。采用嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL發酵時，發酵過程中適當地加入白砂糖可以起到調節口感的作用，但白砂糖的加入并不能有效促進其增長、產酸。從促進乳酸菌增殖、加快產酸方面來看，發酵過程中適當地補入葡萄糖效果可能會更好。菊芋泡菜總酸含量、亞硝酸鹽含量、氨基酸態氮含量一方面取決于原料本身，另一方面主要受發酵時間的影響。低溫發酵延長了泡菜到達所需酸度的時間，從另一方面說明低溫保藏有利于其風味穩定。

3 結論

本文采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL發酵菊芋片，小結如下：

嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有抑菌性。

采用嗜酸乳桿菌LA和乳酸乳球菌LL分別發酵菊芋片14 d時，各組亞硝酸鹽含量均降低至5 mg/kg以下，表明采用嗜酸乳桿菌和乳酸乳球菌發酵菊芋片能有效控制亞硝酸鹽含量，對亞硝酸鹽具有清除作用。

發酵溫度在30～37 ℃時，有利于嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL較快地生長、產酸。其中，采用嗜酸乳桿菌LA發酵產酸較快且亞硝酸鹽含量較低的溫度為34 ℃；采用乳酸乳球菌LL發酵產酸較快且亞硝酸鹽含量較低的溫度37 ℃。

嗜酸乳桿菌LA、乳酸乳球菌LL對蔗糖的利用轉酸能力較弱，發酵過程中加入白砂糖(0～25 g/kg)對發酵菊芋的總酸含量無明顯影響，加糖量5 g/kg時，亞硝酸鹽含量最低。

與乳酸乳球菌發酵相比，采用嗜酸乳桿菌發酵時，發酵液中的氨基酸態氮含量更高。

發酵菊芋的總酸含量、亞硝酸鹽含量、氨基酸態氮含量等各項指標主要受發酵時間的影響，隨著時間延長，各指標值趨于穩定。