嗜熱甘露聚糖酶manBK基因密碼子優(yōu)化表達(dá)及在魔芋聚糖降解中的應(yīng)用

盧海強(qiáng)，谷新晰，袁巧敏，談蘇慧，田洪濤

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）是β-1,4-甘露聚糖水解酶的簡(jiǎn)稱，它可以對(duì)甘露聚糖分子主鏈的內(nèi)部隨機(jī)水解β-1,4-甘露糖苷鍵，在食品加工領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。甘露寡糖是由2～10 個(gè)甘露糖殘基通過(guò)β-1,4-糖苷鍵聚合而成的低聚糖，屬于益生元[4]。近年來(lái)，生物酶解制備甘露寡糖技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，魔芋富含葡甘露聚糖，其水溶液呈高黏度，致使無(wú)法靠增大底物濃度方式提高酶法制備甘露寡糖效率，極大限制了甘露寡糖工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)葡甘露聚糖溶液黏度值隨溫度升高而降低，因此嗜熱甘露聚糖酶在魔芋聚糖深加工中具有巨大應(yīng)用潛力。

嗜熱酶是一類最適溫度為60 ℃以上的酶，主要從嗜熱微生物中獲得[7]。迄今為止，人們已成功獲得了數(shù)十個(gè)嗜熱甘露聚糖酶[8-9]。Thu等[10]從黑曲霉中純化獲得了甘露聚糖酶ManBK01，該酶最適反應(yīng)溫度為80 ℃，屬于嗜熱酶。Do等[11]將該基因進(jìn)行了異源表達(dá)及性質(zhì)測(cè)定研究。由于嗜熱甘露聚糖酶ManBK巨大的應(yīng)用潛力，Huang Jianwen等[12]對(duì)ManBK酶進(jìn)行了晶體結(jié)構(gòu)的解析，探究了結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。目前，關(guān)于提高該酶表達(dá)量及提升酶穩(wěn)定性的相關(guān)研究鮮有報(bào)道，而上述問(wèn)題的解決有利于ManBK酶在食品工業(yè)中的推廣應(yīng)用。

巴斯德畢赤酵母pPIC9K表達(dá)系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)，如高細(xì)胞密度、高表達(dá)量、易于遺傳操作、復(fù)雜的翻譯后修飾能力以及較低的內(nèi)源基因分泌表達(dá)，這使得該系統(tǒng)成為目前最成熟的真核表達(dá)系統(tǒng)之一[13-14]。為進(jìn)一步提升基因的異源表達(dá)，已經(jīng)在巴斯德畢赤酵母中應(yīng)用了許多方法，如增加基因的拷貝數(shù)、選擇合適的信號(hào)肽、高效轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)化[15-17]，其中，將基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化是提高基因表達(dá)量的最有效方法[18]。

因此，本研究通過(guò)對(duì)嗜熱甘露聚糖酶manBK基因密碼子優(yōu)化及工程菌產(chǎn)酶條件研究，探究提升ManBK酶表達(dá)的策略；通過(guò)對(duì)嗜熱酶酶學(xué)性質(zhì)的分析，探討金屬離子對(duì)酶穩(wěn)定性影響及魔芋聚糖酶解產(chǎn)物的抗氧化性性能，旨在為ManBK酶在魔芋深加工行業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴斯德畢赤酵母GS115菌株和質(zhì)粒pPIC9k由本實(shí)驗(yàn)保存；魔芋聚糖（純度＞95%） 合肥博美生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TransI-T1 北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pMDTM19-T、FastpfuDNA聚合酶、T4 DNA酶、EcoR I、NotI和BglII 寶生物工程（大連）有限公司；參照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)制備酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、最少葡萄糖（minimal dextrase agar，MD）培養(yǎng)基、甘油（buffered glycerol complex，BMGY）培養(yǎng)基、甲醇誘導(dǎo)（buffered methanol complex，BMMY）培養(yǎng)基；引物合成和核酸測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

CR-GIII立式高速低溫離心機(jī) 日本日立公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）核酸擴(kuò)增儀 德國(guó)Biometra公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司；1652100電穿孔儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 方法

1.3.1 甘露聚糖酶manBK基因的密碼子優(yōu)化與合成

參照密碼子使用數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.kazusa.or.jp/codon/）中的畢赤酵母相關(guān)數(shù)據(jù)，將黑曲霉來(lái)源的manBK基因中使用頻率低于0.3的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)使用RNA折疊網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器和mRNA翻譯折疊優(yōu)化的密碼子以進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)手動(dòng)校正。GC含量設(shè)定在40%～50%之間，沒(méi)有局部峰，同時(shí)結(jié)合pPIC9K表達(dá)質(zhì)粒的序列特征和插入位點(diǎn)，在目標(biāo)基因的兩端設(shè)計(jì)并添加了酶切位點(diǎn)。其中，在目標(biāo)基因5’端設(shè)計(jì)EcoR I（GAATTC）酶切位點(diǎn)序列；此外，在目標(biāo)基因3’端終止密碼子（TAA）之后添加NotI（CTCGAG）酶切位點(diǎn)，優(yōu)化后的基因由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3.2 重組菌株的構(gòu)建及表達(dá)及分析

以合成的質(zhì)粒pUC57-manBKopt為模板，采用引物manBKopt-PF（5’-GAATTCTCTTTCGCTTCCACTTCCGG TC-3’）（EcoR I）和manBKopt-PR（5’-GCGGCCGCTTA AGCAGAACCGATAGCAGCAACG-3’）（NotI）進(jìn)行基因擴(kuò)增和檢測(cè)。PCR條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。合成后的目標(biāo)基因經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，采用EcoR I和NotI進(jìn)行雙酶切并與pPIC9K質(zhì)粒酶切片段進(jìn)行連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9k-manBKopt；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含氨芐抗生素的LB平板上，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性克隆送生工生物工程（上海）股份公司測(cè)序驗(yàn)證。將pPIC9k-manBKopt質(zhì)粒進(jìn)行BglII酶切線性化，并電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)中，參照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)和酶活性篩選方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選及誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集發(fā)酵液，即為粗酶液，進(jìn)行活力測(cè)定及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.3 ManBK酶活力測(cè)定

參考Miller[19]的3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法，取100 μL適當(dāng)稀釋酶液和900 μL角豆膠（0.5%），在pH 5.0、50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，80 ℃反應(yīng)10 min后，加入1.5 mL DNS終止反應(yīng)。對(duì)照則在加入1.5 mL DNS后，補(bǔ)加100 μL稀釋酶液。沸水浴5 min并冷卻至室溫后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以每分鐘生成1 μmol甘露糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.4 誘導(dǎo)時(shí)間和溫度對(duì)ManBK酶表達(dá)量的影響

將菌株1 mL菌液接種于100 mL的BMGY培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下培養(yǎng)2d后離心收集菌體，轉(zhuǎn)接至100 mL的BMMY培養(yǎng)基中，并在30 ℃搖床培養(yǎng)。收集24、48、72 h和96 h時(shí)分別取樣，離心收集粗酶液，并測(cè)定酶活力，繪制菌株的產(chǎn)酶曲線。

將菌株1 mL菌液接種于100 mL的BMGY培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下培養(yǎng)2 d后離心收集菌體，轉(zhuǎn)接至100 mL的BMMY培養(yǎng)基中，分別在22、25、28、30 ℃和32 ℃條件下200 r/min搖床培養(yǎng)3 d，每隔24 h添加終體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇并取樣測(cè)定酶活力，測(cè)定菌株產(chǎn)酶的最適溫度。

1.3.5 反應(yīng)溫度和pH值對(duì)ManBK酶活力的影響

在pH 2.0～12.0范圍條件下，測(cè)定重組酶ManBK活力，以酶活力最高值為100%計(jì)算，分析該酶的pH值反應(yīng)范圍。最適pH值條件下，分別在30～90 ℃范圍內(nèi)，測(cè)定重組酶ManBK活力，以酶活力最高值為100%計(jì)算，分析其反應(yīng)溫度范圍。

1.3.6 金屬離子對(duì)ManBK酶活力及熱穩(wěn)定性的影響

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，分別測(cè)定終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L的金屬離子條件下酶活力，探究金屬離子對(duì)酶活力的影響，為重組酶的貯藏、純化及應(yīng)用提供一定的指導(dǎo)。

1.3.7 重組酶ManBK動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

在酶最適反應(yīng)條件下，以不同質(zhì)量濃度的角豆膠（10、8、6、5、4、3、2、1 mg/mL）為底物測(cè)定重組酶ManBK活力，根據(jù)米氏方程雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk法）求得Km和Vmax。

1.3.8 魔芋聚糖降解產(chǎn)物含量測(cè)定及組成分析

準(zhǔn)確稱取1 g魔芋聚糖作底物，加入到50 mL pH 5.0的50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液，攪拌30 min，隨后加入50 mL重組酶ManBK（1 100 U），70 ℃水浴90 min，100 ℃加熱滅活10 min，參照Somogyi[20]方法測(cè)定魔芋聚糖降解產(chǎn)物中的直接還原糖（direct reducing sugar，DRS）和總還原糖（total reducing sugar，TRS），并按下式計(jì)算平均聚合度：

平均聚合度=TRS含量/DRS含量

1.3.9 魔芋聚糖降解后的抗氧化性分析

參照Brand-Williams等[21]方法測(cè)定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，具體參照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析及處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3 次，利用Excel和SPSS 19.0軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱甘露聚糖酶優(yōu)化型manBKopt基因的設(shè)計(jì)和密碼子優(yōu)化

不同物種的密碼子使用具有偏好性差異，采用畢赤酵母偏好密碼子替代目標(biāo)基因中的部分密碼子開(kāi)展重組酶的表達(dá)研究，基于巴斯德畢赤酵母有利密碼子合成和構(gòu)建manBKopt基因。來(lái)自黑曲霉甘露聚糖酶manBK基因（XM 006962518.1）全長(zhǎng)為1 152 bp，編碼一個(gè)含有信號(hào)肽序列（38 aa）和成熟蛋白（345 aa）的組成。去除其信號(hào)肽序列后，其成熟肽序列基因總長(zhǎng)為1 038 bp（含終止密碼子）。重新設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因manBKopt與野生型manBK-wt序列的一致性為76%。設(shè)計(jì)后的目標(biāo)基因編碼一條長(zhǎng)度為345 個(gè)氨基酸殘基組成的重組蛋白，與manBK-wt一致。

大量研究指出，密碼子偏好性顯著影響外源基因在表達(dá)宿主中的轉(zhuǎn)錄和翻譯速率。對(duì)manBK-wt基因進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。manBKopt基因密碼子的使用頻率與畢赤酵母差異較大。CTC（Leu）、CGC（Arg）、GCG（Ala）和CCG（Pro）在畢赤酵母中的密碼子使用頻率低于30%，并且存在多個(gè)稀有密碼子聚集，如Leu87（CTC）、Arg89（CGC）和Leu90（CTC）。

CTC（Leu）密碼子使用偏好性差異最大，該基因中共出現(xiàn)13 次。CGC（Arg）密碼子在畢赤酵母中的使用頻率僅為10%，這些數(shù)據(jù)表明manBK-wt基因在畢赤酵母中的表達(dá)會(huì)受到一定的影響。因此，進(jìn)一步對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行優(yōu)化，分別將CTC（Leu）、CGC/CGT（Arg）、GCG（Ala）和CCG（Pro）替換為T(mén)TG/CTG（Leu）、AGA（Arg）、GCT/GCC（Ala）和CCT（Pro）。manBK-wt基因在優(yōu)化前，其密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index，CAI）經(jīng)OptimumGeneTM軟件在線（http://www.genscript.com.cn/technology-support/on-line-tools）計(jì)算為0.61；經(jīng)優(yōu)化后，manBKoptCAI值達(dá)到了0.87。CAI值大于0.8表示該目標(biāo)基因可以在畢赤酵母中高效表達(dá)。經(jīng)分析，manBKopt基因中GC含量的變化范圍為30%～80%，過(guò)高的GC含量會(huì)影響到基因轉(zhuǎn)錄及翻譯速率，經(jīng)優(yōu)化后GC含量變化范圍為40%～53%，這使得GC平均值由54%調(diào)整為47%，共有242 個(gè)堿基進(jìn)行了優(yōu)化。

表1 野生型和優(yōu)化型甘露聚糖酶manBK的密碼子使用頻率Table 1Codon usage frequencies for expression of wild-type and optimized manBK gene in P.pastoris%

續(xù)表1

2.2 重組菌manBK基因誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

用EcoRI和NotI消化manBKopt基因并克隆至pPIC9K中構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切檢測(cè)及DNA測(cè)序結(jié)果分析，正確構(gòu)建pPIC9k-manBKopt。經(jīng)BglII限制酶線性化后，電擊轉(zhuǎn)入到GS115感受態(tài)細(xì)胞并在MD平板上培養(yǎng)，參照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)方法，挑取48 個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行陽(yáng)性篩選，以角豆膠為底物，測(cè)定甘露聚糖酶的活性，共獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子37 個(gè)。選取酶活力最高的30號(hào)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶水平誘導(dǎo)表達(dá)研究。將重組菌株在30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)細(xì)胞發(fā)酵液進(jìn)行酶活力檢測(cè)，為11.4 U/mL。

圖1 ManBK酶的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the ManBK enzyme

經(jīng)SDS-PAGE分析得出重組酶ManBK表觀分子質(zhì)量為45 kDa，比理論分子質(zhì)量37.7 kDa偏大，經(jīng)糖基化預(yù)測(cè)軟件NetNGlyc 1.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分析發(fā)現(xiàn)該蛋白ManBK氨基酸中存在2 個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)（Asn-Xaa-Ser/Thr）分別是N156和N225位點(diǎn)。經(jīng)脫糖基酶Endo H消化后，形成1 條約為38 kDa的蛋白條帶（圖1），結(jié)果表明ManBK酶在表達(dá)的過(guò)程中進(jìn)行了N-糖基化加工修飾。

2.3 工程菌生產(chǎn)ManBK酶條件及酶學(xué)特性分析

圖2 ManBK酶的產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)Fig.2 Production conditions and enzymatic properties of ManBK

由于不同蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、蛋白穩(wěn)定性及宿主蛋白酶的差異，使得誘導(dǎo)溫度對(duì)工程菌的產(chǎn)酶情況有較大影響。經(jīng)測(cè)定，菌株在不同的誘導(dǎo)溫度下產(chǎn)酶量差異明顯，該菌株在25 ℃誘導(dǎo)條件下產(chǎn)酶量最高（圖2A）。誘導(dǎo)溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于酶的正確折疊和后修飾，在22 ℃和32 ℃誘導(dǎo)條件下僅能維持70%的產(chǎn)酶量。如圖2B所示，以1%（V/V）接種量接菌至BMGY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的產(chǎn)酶量也隨之增加，當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后，產(chǎn)酶量達(dá)到最大值，其酶活力為22 U/mL，隨后的24 h產(chǎn)酶量略有減少，這很可能是由于酶受到內(nèi)源蛋白酶或其他因素造成的降解。

ManBK酶在pH 5.0、30～90 ℃條件下的酶活力如圖2C所示。該酶最適反應(yīng)溫度為80 ℃，即使在90 ℃的高溫下仍存在40%的酶活力，屬于嗜熱酶。該酶的反應(yīng)溫度范圍較廣，在30～90 ℃之間具有40%以上的酶活力，能夠滿足不同的反應(yīng)溫度需求。重組酶ManBK的最適pH值為5.0，屬于酸性甘露聚糖酶，該酶在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)酶促反應(yīng)時(shí)能夠維持其70%以上的酶活力（圖2D）。

2.4 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)重組酶活力的影響及動(dòng)力學(xué)參數(shù)

金屬離子種類和濃度對(duì)酶活力的影響差異較大，如表2所示，在低離子濃度條件下（1 mmol/L），K＋、Li＋、Mn2＋和Cu2＋對(duì)ManBK酶有不同程度的抑制作用，其中Li＋的抑制最為強(qiáng)烈（抑制率100%），其他抑制率為20%左右，而金屬離子Fe3＋、Mg2＋、Ca2＋和Zn2＋則極顯著促進(jìn)了重組酶ManBK活性，分別使酶活力提高了32%、23%、52%和459%。進(jìn)一步對(duì)高離子濃度（5 mmol/L）下酶活性的研究結(jié)果表明，Mg2＋和Ca2＋依然對(duì)酶活力有較強(qiáng)烈的促進(jìn)，分別使酶活力提高了234%和263%，而Zn2＋則未表現(xiàn)出酶活力的促進(jìn)作用。

酶的熱穩(wěn)定性直接影響酶使用效果和應(yīng)用范圍，通過(guò)測(cè)定Mg2＋、Ca2＋和Zn2＋作用下，ManBK酶在70、85 ℃和95 ℃條件下的半衰期，探究這3 種離子對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如表2所示。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，Zn2＋能延長(zhǎng)酶的半衰期，使得ManBK酶在70、85 ℃和95 ℃條件下的半衰期分別延長(zhǎng)了116、3.2 min和1.5 min。Mg2＋和Ca2＋并沒(méi)有起到增強(qiáng)酶熱穩(wěn)定性效果。

表2 金屬離子對(duì)ManBK相對(duì)酶活力及熱穩(wěn)定性的影響Table 2 Effect of metal ions and chemical reagents on the activity and thermal stability of ManBK

按照雙倒數(shù)法繪制以角豆膠為底物的ManBK酶的動(dòng)力學(xué)曲線，計(jì)算得出ManBK酶的Km值為1.40 mg/mL，Vmax值為149.25 μmol/（min·mg）。

2.5 ManBK酶在魔芋聚糖降解中應(yīng)用

為更好探究ManBK酶在魔芋聚糖降解中的應(yīng)用特性，進(jìn)行魔芋聚糖酶解過(guò)程中平均聚合度及降解產(chǎn)物抗氧化特性測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 魔芋聚糖降解產(chǎn)物平均聚合度和抗氧化活性的變化規(guī)律Fig.3 Change in polymerization degree and antioxidant activity of konjac glycan degradation products

隨著酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，魔芋聚糖降解產(chǎn)物的平均聚合度逐漸降低，表明ManBK酶將魔芋聚糖進(jìn)行了有效降解，釋放出大量的還原糖。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到1.5 h后，糖含量基本增加不明顯，平均聚合度基本保持不變（圖3），因此當(dāng)酶底比為1∶1時(shí)，反應(yīng)溫度70 ℃，pH 5.0反應(yīng)進(jìn)行1.5 h，即可達(dá)到較合適的酶解時(shí)間。

魔芋聚糖經(jīng)ManBK酶降解后的產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥處理，與VC、甘露寡糖（商品）和魔芋聚糖同時(shí)測(cè)定不同質(zhì)量濃度下的DPPH自由基清除率，上述物質(zhì)都表現(xiàn)出不同程度的抗氧化性，且基本上隨著質(zhì)量濃度的增加抗氧化性能逐漸增強(qiáng)，而重組酶ManBK并未表現(xiàn)出抗氧化性能。魔芋聚糖雖然也表現(xiàn)一定的抗氧化性能，但是經(jīng)ManBK酶降解后制備的魔芋聚糖降解產(chǎn)物的抗氧化性能大幅度增強(qiáng)，兩者抗氧化性能最高相差5.6 倍左右。商品化寡糖與ManBK酶制備的魔芋聚糖降解物的抗氧化性能比較發(fā)現(xiàn)，后者的抗氧化性能是前者的2～4 倍。綜上，ManBK酶在魔芋聚糖深加工中具有極強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

3 討 論

較高的催化反應(yīng)速率、較低的雜菌污染、簡(jiǎn)化的生產(chǎn)工藝等優(yōu)點(diǎn)，使得嗜熱酶在在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用潛力巨大[22]。甘露聚糖酶依據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)的一致性差異可被分為GH5、GH26、GH113和GH134家族，其中GH5和GH134主要分布在真菌微生物中，而GH26和GH113家族主要來(lái)自細(xì)菌[23]。目前，嗜熱甘露聚糖酶主要來(lái)自GH5家族，ManBK01就是其中之一，是唯一完成解析晶體結(jié)構(gòu)的嗜熱甘露聚糖酶。據(jù)報(bào)道，嗜熱酶基因可以在中溫的大腸桿菌和酵母菌表達(dá)宿主中按照正確構(gòu)象進(jìn)行折疊表達(dá)，這使得嗜熱酶可以從中溫表達(dá)宿主中獲得，極大方便對(duì)嗜熱酶的研究。嗜熱甘露聚糖酶manBK在畢赤酵母中異源表達(dá)，經(jīng)性質(zhì)測(cè)定分析發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)酶蛋白與野生型酶蛋白酶學(xué)性質(zhì)一致。如何進(jìn)一步提高嗜熱酶ManBK的表達(dá)量、提高酶的熱穩(wěn)定性、探究酶在食品加工中的應(yīng)用潛力成為該酶研究的新階段內(nèi)容。

manBKopt基因密碼子的使用頻率與畢赤酵母差異較大，其中CTC（Leu）密碼子使用偏好性差異最大，CGC（Arg）密碼子在畢赤酵母中的使用頻率僅為10%。本研究獲得的轉(zhuǎn)化子酶活力為11 U/mL，遠(yuǎn)低于Do等[11]的報(bào)道（660 U/mL）。分析其原因可能是兩者的表達(dá)系統(tǒng)的差異所致，本研究采用pPIC9K和畢赤酵母GS115表達(dá)系統(tǒng)，而Do等[11]采用pPICZαA和畢赤酵母X33表達(dá)系統(tǒng)；另外一個(gè)可能原因是manBK基因在兩者宿主中的拷貝數(shù)的差異，在一定程度上基因拷貝數(shù)與基因表達(dá)量呈正相關(guān)，兩者最終子宿主的拷貝數(shù)差異還需進(jìn)一步研究。經(jīng)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，本研究所表達(dá)蛋白純度較高，電泳純能達(dá)到99%，能夠大幅度簡(jiǎn)化對(duì)酶下游的提取工藝。

研究發(fā)現(xiàn)重組酶ManBK的表觀分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于其理論分子質(zhì)量，經(jīng)分析酶蛋白分子的N-糖基化是造成分子質(zhì)量增大的主要原因。產(chǎn)物的糖基化修飾作為真核表達(dá)系統(tǒng)重要的加工修飾方式，影響產(chǎn)物的分子質(zhì)量、穩(wěn)定性和催化效率等諸多屬性，真核生物的糖基化對(duì)于維持蛋白的功能及穩(wěn)定性方面有重大的作用[24-25]，而對(duì)其他性質(zhì)（如催化效率和熱穩(wěn)定性）的影響并不清楚，還需進(jìn)一步分析。 重組酶ManBK最適pH值為5.0，這與大多數(shù)GH5家族甘露聚糖酶的性質(zhì)相類似（最適pH 1.5～7.0）[26]。ManBK酶最適反應(yīng)溫度為80 ℃，并且該酶即使在90 ℃時(shí)依然能夠維持40%的酶活力，屬于典型嗜熱酶，這與Do等[11]研究結(jié)果一致。

Zn2＋、Ca2＋和Cu2＋對(duì)該酶活力性有較大促進(jìn)，Do等[11]也得出了一致的結(jié)論，但是上述金屬離子對(duì)甘露聚糖酶的影響效應(yīng)并不適用于所有甘露聚糖酶，如Yin等[27]報(bào)道Zn2＋和Cu2＋對(duì)甘露聚糖酶具有強(qiáng)烈抑制作用，使活性降低了60%和80%。Regmi等[28]研究發(fā)現(xiàn)，Ca2＋抑制了20%左右的酶活力。對(duì)于提升酶的熱穩(wěn)定性普遍采用酶的定向改造、包被處理，而采用金屬離子輔助提升酶穩(wěn)定性的相關(guān)研究較少[29-30]。本研究除探究金屬離子對(duì)酶活力性的影響之外，經(jīng)Zn2＋、Ca2＋和Cu2＋對(duì)酶熱穩(wěn)定性分析發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L濃度下，Zn2＋對(duì)酶的熱穩(wěn)定性表現(xiàn)出了較好的促進(jìn)作用，使得重組酶ManBK在70 ℃的半衰期增長(zhǎng)116 min。本研究對(duì)采用嗜熱甘露聚糖酶制備甘露寡糖進(jìn)行了聚合度及抗氧化性分析，嗜熱酶能夠?qū)⒛в缶厶歉咝Ы到獬傻途厶牵耶a(chǎn)物表現(xiàn)出較好的抗氧化性能。