油菜FBA基因克隆、表達分析及其與抗旱性的關系

謝小玉,何巧麗,侯 爽,張小短,馬仲煉

西南大學農學與生物科技學院, 重慶 400715

季節性干旱是油菜生產的主要自然災害之一,尤其春旱使我國長江中下游地區的油菜平均減產20%以上[1]。研究表明,干旱脅迫下油菜的凈光合速率(the net photosynthetic rate,Pn)降低[2],隨干旱脅迫時間的延長,下降幅度不斷增加,下降幅度與油菜抗旱性有關[3]。油菜產量與蕾苔期葉片凈光合速率抗旱系數呈極顯著正相關[4]。要提高油菜的抗旱性,就需提高干旱脅迫下油菜的光合效率。果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,FBA)既參與了糖酵解和糖異生過程,同時又參與了磷酸戊糖途徑和卡爾文循環[5-6],對細胞生命活動起著至關重要的作用。對油菜的研究發現FBA基因參與干旱脅迫應答。通過對FBA基因的克隆、表達分析及干旱脅迫下基因表達量與凈光合速率、產量等之間的關系分析,對于揭示FBA基因在油菜抗旱中的作用及對油菜抗旱性鑒定和抗旱性改良具有重要意義。

前人研究表明,在自然界中存在兩類FBA,有不依賴金屬離子的第Ⅰ類酶和依賴金屬離子的第Ⅱ類酶[7]。高等植物中的FBA均為I型,又存在2種亞型,即胞質型FBA和質體型FBA[8]。前者存在于細胞質基質中,參與糖酵解和糖異生途徑,催化果糖- 1,6-二磷酸的裂解[9-10];后者分布于葉綠體中,參與卡爾文循環中1,5-二磷酸核酮糖的再生[11-12]。近幾年研究表明,植物的果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶不僅參與了很多的生理和生化過程[13- 15],還參與了植物對高溫[16]、低溫[8]、干旱[17]、鹽[10,18]、鎘[19]、硼[20]等多種脅迫的響應和信號傳導過程。Lu 等[8]發現鹽脅迫下擬南芥的FBA基因家族成員中的AtFBA3、AtFBA4、AtFBA6 和AtFBA8 表達量均上調;Fan 等[10]研究表明海馬齒的FBA基因在鹽脅迫后強烈表達,超表達后可以明顯提高植株的耐鹽性;胡楊細胞質中的果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶通過促進糖酵解和有氧呼吸途徑提高植物對鹽脅迫的適應性[21]。Larkindale等[22]研究表明37℃的高溫顯著誘導擬南芥AtFBA6基因的大量積累。孫勝楠等[23]研究表明,FBA活性與基因表達均受高溫誘導,誘導效應與溫度升高幅度和高溫持續時間有關。通過表型分析及基因芯片檢測發現,在擬南芥低溫致死的突變體中,FBA基因的表達量發生了明顯的上調[24]。干旱脅迫下,擬南芥的AtFBA1,6,8表達量上調8倍以上[25];陳娜[26]等的研究也表明,FBA基因可能參與花生對高鹽和干旱脅迫的適應性調控。目前研究者們已克隆出了紫花苜蓿[27]、番茄[16]等多種植物的FBA基因序列,Uematsu等[12]通過將擬南芥的質體FBA基因在煙草中進行異源表達,使轉基因煙草的光合速率增加,促進了轉基因煙草的生長和生物量的積累。但至今未見關于油菜FBA基因研究的報道。

本研究通過對前期構建的基于干旱脅迫下甘藍型油菜 SSH文庫[28]的測序分析,發現FBA基因參與干旱脅迫應答。在此基礎上,采用RACE方法對基因進行全長克隆、測序和生物信息學分析;利用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定FBA基因表達量,分析表達量與干旱脅迫下油菜光合指標、酶活性、產量等之間的關系,明確FBA基因與油菜抗旱性的關系,為油菜FBA基因功能研究以及利用FBA基因改良作物抗旱性提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試驗處理

供試材料為經鑒定抗旱能力強的甘藍型油菜94005(由重慶市油菜工程研究中心提供)。挑選籽粒飽滿、大小均一的油菜種子,用15%的次氯酸鈉消毒20 min,然后用無菌水清洗5次,播種于室內以蛭石和草炭(1∶1)為基質的塑料營養缽中,在室溫下培養至幼苗四葉一心時將其移栽到遮雨人工網室內的盆缽中(盆高40 cm,直徑30 cm,盆中所用基質為草炭土、自然土壤和蛭石按1∶3:1比例混合而成的混合物,基質提前用多菌靈和敵百蟲殺菌滅蟲,每盆裝基質15.0 kg,使其達9成滿,施氮磷鉀復合肥30 g),每盆定植2 株,期間進行正常的田間管理。

油菜生長至初花期,選擇長勢良好且生長一致的植株進行干旱處理,分為5組：正常供水(control, CK)、輕度干旱(lightly drought, LD)、中度干旱(moderate drought, MD)、重度干旱(severe drought, SD)和極度干旱(extreme drought, ED),其土壤相對含水量分別為65%—75%、50%—55%、40%—45%、20%—30%、10%—15%。每個處理種植8盆,共16株。自然干旱至設定土壤相對含水量標準范圍,每天8:00和18:00采用稱重法補水控水,處理期間除盆內土壤含水量差異外其他管理一致,土壤相對含水量達到干旱脅迫條件時持續7d取樣測定,之后復水使土壤含水量恢復到對照水平,并正常水分管理培養至成熟期測定產量。

1.2 試驗方法

1.2.1抑制消減雜交(Suppression subtractive hybridization, SSH)文庫構建

對干旱脅迫的植株分別在第1天、第3天、第5天和第7天 9:00—9:30 采集對照和處理頂部完全展開的第1葉混合,液氮速凍,-80℃保存。進行RNA的提取及mRNA的純化,抑制性消減雜交,SSH-cDNA文庫構建以及差異表達序列測序和生物信息學分析[30]。

1.2.2光合參數的測定

用美國LI-COR公司生產的LI- 6400光合儀,在干旱脅迫的第7天(晴天)10：00點左右,對對照和處理植株的頂部外部向陽完全展開的長勢一致的第2—3片葉測定凈光合速率(Net photosynthetic rate,Pn)、氣孔導度(Stomatal conductance,Gs)、胞間CO2濃度(Intercellular CO2concentration,Ci)、蒸騰速率(Transpiration rate,Tr),采用LI- 6400-02B紅藍光光源,設定光強為1600 μmol m-2s-1,溫度為25℃,大氣CO2濃度(Ca)為400 μmol/mol,空氣相對濕度為50%—70%;計算水分利用率(Water use efficiency, WUE),水分利用率(WUE)=光合速率(Pn)/蒸騰速率(Tr)。采用輪回測定的方法,每個處理測定3株。

1.2.3FBA酶活性的測定

剪取測定完光合參數的葉片,-20℃保存,采用上海優選生物科技有限公司的植物果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶試劑盒(微量法)測定FBA的活性,所有操作步驟均按照試劑盒說明書進行。

1.2.4FBA基因表達量的測定

剪取測定完光合參數的葉片,液氮速凍,-80℃保存,采用天根公司的RNA prep pure植物總RNA提取試劑盒提取總RNA,利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA的完整性,用紫外分光光度計測定純度。使用TAKARA公司的PrimerScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒進行RNA的純化和反轉錄合成cDNA, 根據SSH文庫中FBA基因的 EST(表達序列標簽,Expressed sequence tag) 序列,利用Vector NTI軟件和primer premier 5.0軟件設計引物,正向引物為5′-TACCTGGCATCAAAGTCGACAA- 3′,反向引物5′-TCG TAGTACTTCTTGCAACGCT- 3′。以ACT7和UBC12為候選內參基因,通過基因表達穩定性的分析[29],以ACT7為內參基因,正向引物TGGGTTTGCTGGTGACGAT,反向引物TGCCTAGGACGACCAACA ATACT。使用BIO-RAD公司的iTaq TM Universal SYBR? Green Supermix試劑盒進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)擴增。PCR程序為：95℃ 3min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,45個循環;72℃ 10 min。每個樣品4個重復,采用2-ΔΔCt計算基因表達量[30]。

1.2.5FBA基因的全長克隆

采用Clontech 公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得基因的3′端序列。以RACE-Ready c DNA為模板,在試劑盒提供的通用引物UPM及基因特異性引物GSP引導下,用Advantage 2 Polymerase Mix催化合成相關基因的cDNA末端。引物序列為：FBA- 1: AGGAAGGAGGAGTCTTACCT GGCATCA、FBA- 2: TCGACAAGGGCACCGTTTCTCTACC,第一輪PCR擴增,反應條件：94℃ 3 min;94℃ 30 sec,68℃ 30 sec,72℃ 3 min,25循環;72℃ 10 min;再進行第二輪PCR擴增,反應條件：94℃ 3 min;94℃ 30 sec,68℃ 30 sec,72℃ 3 min,25循環;72℃ 10 min;PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,按TIANGEN普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行凝膠回收,回收純化后的PCR產物送上海生工測序。

1.2.6測序結果的生物信息學分析

采用NCBI網站(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)上的 BLAST 工具對所測得的序列進行基因序列的相似性及同源性查找,并利用這些序列進行基因同源性的比較,用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 在線分析全長序列的開放閱讀框(Open reading frame, ORF),利用 DNAMAN 軟件將基因的 ORF序列翻譯成氨基酸,利用Protparam (http://web.expasy.org/protparam/)預測蛋白的理化性質,利用 PSORT II Prediction(http://psort.hgc.jp/form.html)進行亞細胞定位預測;采用PredictProtein (http://www.predictprotein.org/)預測蛋白的二級結構,運用 SWISS-MODEL對氨基酸序列進行蛋白質三級結構預測分析,用Raswin 視圖軟件得到該蛋白質三維結構。用Vector NTI Advance11.5程序進行序列比對分析,用MEGA5.2.2軟件構建進化樹,在SOPMA和SWISS MODEL網站上進行蛋白質結構分析。

2 結果與分析

2.1 SSH分析發現FBA基因與抗旱有關

通過對干旱誘導的SSH文庫中646個經PCR鑒定的陽性克隆測序,獲得639個單一的EST,經過聚類、拼接和去除冗余,獲得重疊群(contigs)89條,單拷貝序列 (singleton)97條。對測序獲得的186條unigene進行Blastn和Blastx數據庫的序列比對,發現其中166條具有同源基因,20條沒有匹配項。具有同源基因的EST中154條與已知功能的蛋白有同源性,其中果糖- 1, 6-二磷酸醛縮酶基因11條,占具有同源性基因的6.63%。表1列出了部分ESTs。

2.2 FBA基因的克隆與序列分析2.2.1 FBA基因的RACE克隆

在已獲得的保守區基礎上,以3′RACE的cDNA為模板,經2輪PCR之后擴增出大小約900bp的單一DNA片段。將第二輪PCR產物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化測序,測序結果提交Genebank,命名為BnFBA1,基因登錄號為 MH316131。經過軟件分析,確認此片段大小為975 bp,與保守區序列有368 bp的重疊片段,是油菜FBA的mRNA3′端序列。

2.2.2FBA基因的序列分析

(1) 油菜BnFBA1基因編碼產物的基本性質分析

用DNAMAN V6將測序結果與已知FBA序列進行拼接,得到FBA全長序列1440bp,預測基因的ORF位于60—1170區域(共1107bp),編碼369個氨基酸。

經ProtParam分析,FBA蛋白序列分子量為38.51 KDa,等電點6.92,酸性氨基酸殘基(Asp+Glu)總數為70個,堿性氨基酸殘基(Arg+Lys)總數為47個,原子總數為5445,分子式為C1705H2738N466O526S10,半衰期為30h,穩定系數29.51,是穩定蛋白。 較高含量的氨基酸有Ala(丙氨酸,10.6%),Leu(亮氨酸,10.1%),不含Pyl(苯丙氨酸)和Sec(絲氨酸)。亞細胞定位分析表明該蛋白是細胞質蛋白。

表1 油菜葉片干旱脅迫下誘導表達的部分基因

(2) 油菜BnFBA1蛋白高級結構的預測

BnFBA1基因編碼的蛋白的二級結構預測結果(圖1)表明,該基因編碼的氨基酸序列由43.85%的α螺旋(alpha helix) 、31.28%的無規卷曲(random coil) 、17.60% 的延伸鏈(extended strand)、7.26%的β轉角(beta turn)構成。

圖1 BnFBA1蛋白二級結構預測Fig.1 The predicted secondary structure of BnFBA1 protein藍色:α螺旋; 紫色:無規則卷曲; 紅色:延伸鏈; 綠色:β轉角

BnFBA1蛋白的三級結構預測(圖2)模型中清晰地看到α螺旋和β片層結構,與二級結構預測結果基本一致。

圖2 BnFBA1蛋白三級結構預測模型Fig.2 Predicted 3-D dimensional structure of BnFBA1 protein

(3) 不同物種間BnFBA1基因編碼蛋白質同源性分析

多重序列比對分析顯示甘藍型油菜94005的BnFBA1與擬南芥、花生、野生大豆、苜蓿等7種植物的細胞質FBA有69.8%的總體同源性(圖3);從構建的系統進化樹(圖4)可看出,甘藍型油菜94005的細胞質FBA與擬南芥的細胞質FBA同源性最高。

2.3 FBA的表達分析及其與抗旱性關系2.3.1 干旱對油菜葉片FBA表達量的影響

所有提取的葉片總RNA通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后的結果表明18S與28S條帶清晰、明亮,28S條帶比18S條帶更亮,兩者之比大于1。經核酸蛋白檢測儀檢測,提取的總RNA的OD260/OD280值均在2.0—2.2之間,表明提取的總RNA完整、質量高、純度好,達到了反轉錄和RT-qPCR的要求(圖5)。

實時熒光定量PCR結果(表2)表明,在干旱脅迫下,FBA基因的表達量隨著干旱脅迫程度的增加而增加,其中輕度、中度、重度和極度干旱下上升幅度分別為1.73%,3.97%,6.48%,7.23%。

2.3.2FBA的表達與抗旱性的關系

(1)干旱脅迫下油菜產量、光合特性及FBA活性的變化

表3表明,隨著干旱脅迫的加劇,油菜產量、葉片Pn、Gs以及Tr下降幅度加大。在輕度、中度、重度和極度干旱脅迫下,產量分別較對照降低40.78%、45.55%、53.69%、62.90%,Pn分別較對照降低17.96%、45.42%、65.43%、82.71%,Gs分別較對照降低34.02%、65.98%、83.50%、84.87%,Tr分別較對照降低26.55%、47.57%、78.13%、80.54%。

表2 干旱脅迫下BnFBA1基因的表達情況

FBA活性隨著干旱脅迫的增加而增加,輕度、中度、重度和極度干旱脅迫下,分別比對照高18.45%、31.69%、32.35%、35.66%。而Ci隨著干旱脅迫的加劇降低,到重度干旱下達到最低,而極度干旱下又上升; WUE隨著干旱脅迫的加劇不斷上升,到重度干旱脅迫下達到最大,極度干旱脅迫下又下降。

表3 干旱脅迫對油菜產量、光合特性及FBA活性的影響

圖4 油菜BnFBA1的系統進化樹 Fig.4 Phylogenetic relationship of amino acid sequences between BnFBA1 and other species

圖5 總RNA電泳圖Fig.5 Electrophoresis profile of total RNA M代表標記,1/2/3/4/5代表CK/LD/MD/SD/ED/,6/7/8/9/10為重復;CK:正常供水Control; LD:輕度干旱Llightly drought; MD:中度干旱Mmoderate drought; SD:重度干旱Severe drought; ED:極度干旱Extreme drought

(2)干旱脅迫下FBA基因表達量、酶活性和油菜產量等指標的關系

用SPSS 17.0軟件分析干旱脅迫處理下油菜FBA基因的表達量與酶活性、產量、光合參數的相關性(表4)表明,FBA表達量與FBA活性呈顯著正相關,與Pn、Gs、Tr呈極顯著負相關,與產量呈顯著負相關。FBA活性與干旱脅迫下Pn呈顯著負相關,與產量、Gs、Tr呈極顯著負相關。

3 討論

3.1 FBA基因與油菜抗旱性密切相關

FBA作為一類重要的糖代謝酶,處于6C糖可逆地轉化為3C糖的關鍵部位,越來越多的證據表明這一家族在許多代謝和發育過程中扮演著重要的作用[31]。近年來,FBA相繼在擬南芥[8]、番茄[16]、黃瓜[31]等不同的物種中展開了研究,發現FBA基因除了受光照、溫度、鹽等非生物因素的脅迫外,還參與了植物的干旱調控[8,17]。本研究從干旱脅迫下的SSH文庫分析發現FBA參與油菜對干旱脅迫的應答;干旱脅迫下,油菜BnFBA1基因表達量和酶活性增加,這與擬南芥的研究結果相同[25]。這說明FBA是干旱脅迫響應基因。

干旱脅迫導致油菜葉片Gs、Tr、Pn和產量下降;在輕度(Lightly drought, LD)、中度(Moderate drought, MD)和重度(Severe drought, SD)脅迫下,Ci下降、WUE提高,而在極度干旱(Extreme drought, ED)下,Ci上升、WUE下降,可能是由于干旱脅迫下果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶參與糖酵解,分解葡萄糖,使細胞內糖分降低,水勢升高,氣孔關閉;而在極度干旱(ED)下由于氣孔關閉時間較長,Ci升高,細胞內pH值降低,水勢降低,WUE下降,Pn下降,果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶參與糖酵解并合成甘油來調節細胞內滲透壓以提高油菜抗旱性。

表4 油菜產量、基因表達量、酶活性、凈光合速率的相關性

3.2 克隆的油菜BnFBA1基因屬于胞質型FBA

干旱處理小麥7d后,包括果糖- 1,6-二磷酸醛縮酶在內的一系列參與卡爾文循環的酶基因表達協同下調[32]。而本研究表明,干旱脅迫下BnFBA1基因表達上調,FBA基因表達量、FBA酶活性與油菜葉片Pn、產量呈顯著負相關。對成功克隆的BnFBA1同源的氨基酸序列對比顯示甘藍型油菜94005的FBA與擬南芥、花生、大豆、苜蓿等7種植物的細胞質FBA有69.8%的總體同源性;與擬南芥的細胞質FBA同源性最高。這表明FBA在進化過程中保證了足夠的遺傳穩定性,克隆的BnFBA1基因屬于胞質型FBA,這與亞細胞定位預測結果一致。

3.3 需進一步研究的問題

前人研究表明,FBA基因一方面改變植物糖類物質的代謝,另一方面可調節植物的生殖生長[25],本研究中干旱脅迫下油菜產量降低是否是由于FBA促進生殖生長提前而導致產量下降,還需進一步研究。同時,后期實驗進一步發掘更多的FBA基因,進一步分析蛋白二級、三級結構與抗旱性的關系,深入研究胞質型FBA調控糖代謝和生殖生長的過程及該基因家族在油菜干旱脅迫下的調節機制。

4 結論

從油菜中成功克隆獲得1條FBA基因,該基因與油菜抗旱性密切相關,屬于胞質型FBA。