凋落物添加和移除對杉木人工林土壤水解酶活性及其化學計量比的影響

劉 仁,陳伏生,方向民,萬松澤,卜文圣,王輝民,李建軍,*

1 江西農業大學林學院江西省森林培育重點實驗室,南昌 330045 2 江西農業大學鄱陽湖流域森林生態系統保護與修復國家林業和草原局重點實驗室,南昌 330045 3 中國科學院地理科學與資源研究所生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室,北京 100101

土壤水解酶是土壤微生物和植物分泌的胞外酶,其活性和產量與土壤C、N、P養分有效性密切相關[1],主要包括：降解纖維素的β-1,4-葡萄糖苷酶(BG,β-1,4-glucosidase)和半纖維素酶(CB,cellobiase),降解幾丁質和肽聚糖的β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG,β-1,4-N-acetylglucosaminidase),水解蛋白質和多肽的亮氨酸氨基肽酶(LAP,leucine aminopeptidase),分解有機磷的酸性(或堿性)磷酸酶(AP,acid or alkaline phosphatase),這些酶的活性比值被稱為生態酶化學計量比,可用于指示土壤C、N、P三類養分的有效性以及土壤微生物C、N和P養分需求狀況[2],因此生態酶化學計量比在驅動土壤C、N、P養分循環過程中發揮重要作用[3-4]。化學計量比理論是基于化學反應中反應物和生成物的相對數量關系,該理論也適用于土壤生態酶化學計量比[5]。目前,土壤生態酶化學計量比相關研究已成為生態系統養分循環的熱點。研究發現,C水解酶(如：BG和CB)、N水解酶(如：NAG和LAP)和P水解酶(如：AP)活性分別與土壤中C、N和P 的有效性呈負相關關系[6],另外土壤酶活性及其化學計量比均受到土壤 pH、溫濕度等因素的調控[7]。以往對土壤養分和生態酶化學計量比相結合的研究主要基于植物物種水平[8],且集中在全球和流域尺度[9-10],而在人工林生態系統中的變化規律仍不明確。

森林管理可以改變森林生態系統的結構和功能[11]。作為林下管理的常用方法,從森林中收集凋落物作為燃料和農場動物草墊的做法一直沿用至今[12]；以往研究表明,凋落物移除可能加劇人工林生態系統土壤養分和森林生產力的衰退過程[13]。全球氣候變化背景下,氮沉降加劇和大氣CO2濃度升高所產生的“施肥效應”可能增加樹木的生產力,最終可能使凋落物的產量增加[14]。凋落物輸入量的變化可以通過改變輸入土壤中C、N、P等養分的數量和質量對森林生態系統內部養分循環產生影響[15]。研究發現：凋落物添加可以促進土壤C和其他養分的循環[16]；而凋落物移除可能對土壤養分循環過程產生負效應[17]或無顯著影響[18]。關于凋落物添加和移除對土壤養分影響的研究開展了許多,然而就凋落物量改變如何調控土壤生物和非生物因素,進而對土壤生態酶化學計量比產生影響還需進行深入研究。

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國南方最重要的速生優良用材樹種。杉木的速生特性導致其在生長期間高效吸收土壤養分,而凋落物輸入量的改變可能造成土壤養分輸入和輸出過程嚴重失衡[19],最終可能導致土壤酶活性比值發生相應變化。但從生態酶化學計量比角度來探討凋落物量變化對土壤養分狀況影響的研究較少。本區域一項研究探討過土壤酶活性對凋落物輸入量的響應[20],而從生態酶化學計量比的角度探討凋落物處理效應的研究鮮有報道。為此,本試驗以亞熱帶杉木人工林為研究對象,通過研究凋落物添加和移除處理后土壤理化性質和水解酶活性及其化學計量比的變化來檢驗凋落物輸入量改變對土壤養分狀況的影響,進而揭示凋落物添加和移除對土壤-酶化學計量特征發生變化的機制。根據已有研究,我們提出以下科學假設：(1)杉木人工林土壤通常處于養分貧瘠狀態,微生物代謝可能受到限制,而凋落物移除通過減少養分的輸入而使土壤養分限制加劇[21],最終可能刺激微生物分泌更多特異性胞外酶,使土壤酶活性增加,而凋落物添加可能使土壤酶活性降低或者變化不顯著；(2)土壤酶化學計量比可以確定微生物養分需求與土壤養分供應之間的關系[8],因此我們推測土壤生態酶化學計量比與土壤養分化學計量比之間可能存在對應關系。本試驗結果可能從生態酶化學計量比的角度來揭示亞熱帶杉木人工林凋落物添加和移除處理下土壤養分的響應和調控機制,這將有助于完善土壤生態酶化學計量比理論體系,同時也為不同林下管理對土壤養分影響的評估提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

試驗樣地位于江西省泰和縣中國科學院千煙洲石溪林場(26°44′52″N,115°04′13″E),該區地處亞熱帶季風氣候區,雨量充沛,四季分明,海拔102m,年平均氣溫17.9℃,年平均無霜期 280d,年平均降雨量1471mm,是典型的紅壤丘陵地貌,成土母質多為紅色砂巖、砂礫巖或泥巖以及河流沖積物[22]。試驗樣地為 1998 年人工種植的二代杉木純林,2013年杉木平均高度為 13.6m,胸徑為 11.4cm,郁閉度 76%,林齡為15a,坡向為東南方向,坡度為15°；林下灌木層主要物種有毛冬青(Ilexpubescens)、黃瑞木(Adinandramillettii)、紫珠(Callicarpabodinieri)和黃梔子(Gardeniajasminoides)等[23]。

1.2 試驗設計

本試驗始于2013年1月,在江西省吉安市泰和縣千煙洲石溪林場杉木人工林設置4個30 m×30 m 樣地(樣地間設置>5m的緩沖帶),隨機排列。每個樣地通過“十字形”壕溝(規格：長30m,寬0.3m和深度1m,降低樣方間水分和養分的交換速率,壕溝以內1m范圍為緩沖區,禁止緩沖區取樣)分割成4個15m×15m樣方[20]。在每個樣地的4樣方間隨機安排本研究的3個凋落物處理,每個處理4次重復,合計12個小區。3個凋落物處理分別是凋落物移除(LR)：將樣地內全部凋落物移出樣地；凋落物添加(LA)：將從去除凋落物樣地收集的凋落物均勻灑在樣方內；對照(CK)：凋落物不做任何處理。由于杉木枝葉同時掉落,加之每月凋落物量較少,因此凋落物處理每月進行一次,保證凋落物處理效果。

1.3 樣品采集

2018年7月,在每個15m×15m小樣方內沿“Z”型布置12個取樣點,首先用三角鏟收集50cm×50cm方格內礦質層以上的腐殖質樣品12份,混合均勻并用四分法采集約500g,裝入無菌自封袋內,做好標記放入冰盒；然后用直徑5cm的土鉆在該方格內取3個點各采集0—5cm,5—10 cm土層土壤,并把12個取樣點0—5cm和5—10 cm兩土層分別鉆取的36個土樣混合,用四分法采集約500g土壤裝入無菌自封袋內,做好標記放入冰盒,迅速帶回實驗室,去除石塊、根系等其它雜質,然后依次過2 mm 孔徑的土壤篩后分為兩部分,一份放至4℃冰箱內進行冷藏保存測酶活性和速效氮,另一份土樣風干測pH、SOC、TN、TP養分含量[20]。

1.4 樣品分析

1.4.1土壤理化性質

1.4.2土壤酶活性

用熒光標記底物法測定5種土壤酶(BG、CB、NAG、LAP和AP)的活性[25]。將1.5g新鮮土壤加入125 mL的乙酸鈉緩沖液(50 mol/L)中制備土壤懸浮液。在96微孔板中加入200 μL的土壤懸浮液和50 μL的底物(200 μmol/L)溶液。將微孔板置于20℃黑暗條件下培養4 h,每個孔中加入10 μL的NaOH溶液(1 mol/L),靜置1 min后,用多功能酶標儀(SpectraMax M2,美國)在365 nm下激發,450 nm下檢測熒光值。每個樣品8個重復。

1.5 數據分析

本研究采用SPSS 19.0軟件的雙因素方差分析(Two-way ANOVA)中的最小顯著性差異(LSD)法比較不同處理與不同土層間5種土壤酶活性、生態酶活性化學計量比和土壤理化性質的差異性,并采用 Pearson 相關分析土壤酶化學計量比與土壤理化性質之間的相關性,在此基礎上利用Canoco5軟件評價以土壤酶活性為響應變量,土壤基本理化性質及C、N、P 元素計量比為解釋變量進行冗余分析RDA(P< 0.05),ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)表示土壤酶化學計量C:N；ln(BG+CB):ln(AP)表示土壤酶化學計量C:P；ln(NAG+LAP):ln(AP)表示土壤酶化學計量N:P[1]。本研究的圖形繪制均在Origin8.0中完成。

2 結果與分析

2.1 凋落物添加和移除處理對不同土層土壤理化性質的影響

2.2 凋落物添加和移除處理對不同土層土壤酶活性的影響

凋落物處理和土層均顯著影響AP、BG、CB、NAG和LAP酶活性,凋落物處理與土層的交互作用對AP、BG、NAG和LAP酶活性影響顯著(表1)。與CK相比較,LR使腐殖質層中的BG、CB、NAG和LAP酶活性均降低(P<0.05),而LA僅增加了腐殖質層AP活性,增幅為16.18%。就0—5cm土層而言,LA增加了土壤 CB和NAG活性,而LR對二者存在抑制作用；0—5cm土壤層中的AP、BG和LAP水解酶活性僅表現出顯著的凋落物添加正效應,而對LR無影響。在5—10cm土層中,LA使BG、CB和LAP活性增加,而LR分別使AP和CB活性降低了37.56%和45.36%。比較3個土層土壤酶活性發現,3種處理下的AP和BG活性均表現為0—5cm和5—10cm土層低于腐殖質層(P<0.05),其中0—5cm和5—10cm土層間差異不顯著。另外,在3種凋落物處理下CB、NAG和LAP 3種酶活性隨土層深度的增加而顯著降低(圖1)。

表1 土層和凋落物處理對不同理化性質、酶活性及其化學計量比的影響的雙因素方差分析(F值)

表2 凋落物添加和移除對杉木人工林不同土層下的土壤理化性質的影響

圖1 凋落物添加和移除處理對不同土層的土壤水解酶的影響Fig.1 Effects of litter addition and removal treatment on soil hydrolytic enzymes in different soil layersCK：凋落物保留(對照)Control；LR：凋落物移除 Litter removal；LA：凋落物添加 Litter addition,Humus layer：腐殖質層;不同大寫字母表示同一處理中不同深度土層之間的差異性,不同小寫字母表示同一土層中不同處理之間的差異,AP：酸性磷酸酶Acid phosphatase；BG：β-葡萄糖苷酶β-glucosidase；CB：半纖維素酶Cellobioside； NAG：乙酰葡萄胺糖苷酶β-N-acetyl-glucosaminidase；LAP：亮氨酸基肽酶Leucine aminopeptidase

2.3 凋落物添加和移除處理對不同土層土壤養分和酶活性化學計量比的影響

土層對土壤養分和酶活性化學計量比的影響顯著,凋落物處理只對C/N和C/P的影響顯著,兩者的交互作用顯著影響C/N、C/P和酶活性化學計量比(表1)。LR增加了腐殖質層的N/P,而LA降低腐殖質層N/P,同時還增加了3個土層C/N、C/P。與CK相比較,LA使腐殖質層和0—5cm土壤層的ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)分別減少了10.00%和17.60%,另外LR降低了0—5cm土壤層的ln(NAG+LAP):ln(AP) 和5—10cm土壤層的ln(BG+CB):ln(AP)。

在3種凋落物處理中, C/P、N/P和ln(NAG+LAP):ln(AP)均隨土層深度的增加而降低,而ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)和ln(BG+CB):ln(AP)則表現為腐殖質層高于0—5cm和5—10cm土層(表3)。

2.4 土壤理化性質與土壤水解酶活性及其化學計量比的相關分析

表3 凋落物添加和移除處理對不同土層的土壤養分和酶化學計量比的影響

圖2 土壤理化性質與土壤水解酶活性的相關性Fig.2 Correlation between soil physical and chemical properties and soil hydrolytic enzyme activitySMC：土壤含水量 Soil moisture content；pH：土壤酸堿度 Soil pH；SOC：土壤有機碳 Soil organic carbon；TN：土壤總氮 Total nitrogen；TP：土壤總磷 Total 銨態氮 Ammonium 硝態氮 Nitrate nitrogen；C/N：碳氮比Carbon:nitrogen ratio；C/P：碳磷比Carbon:phosphorus ratio；N/P：氮磷比Nitrogen:phosphorus ratio, AP：酸性磷酸酶Acid phosphatase；BG：β-葡萄糖苷酶β-glucosidase；CB：半纖維素酶Cellobioside；LAP：亮氨酸基肽酶Leucine aminopeptidase；NAG：乙酰葡萄胺糖苷酶β-N-acetyl-glucosaminidase

表4 土壤理化性質與土壤酶活性化學計量比的相關性

3 討論

3.1 凋落物添加和移除處理對土壤理化性質及酶活性的影響

土壤水解酶作為評價土壤微生物活性及土壤肥力的重要指標,其活性的高低直接影響養分循環的效率。本研究發現凋落物輸入量的改變會對亞熱帶杉木人工林土壤酶活性產生顯著的影響。與假設(1)不同,本研究發現LR顯著降低了土壤AP、BG、CB、NAG和LAP酶的活性,該結果與歐洲落葉林[26]、溫帶落葉橡樹林[27]、亞熱帶米櫧人工林[28]和熱帶雨林[29]的凋落物移除試驗研究結果一致,這些研究認為,LR通過限制土壤微生物碳源和酶促反應底物的供應來調控土壤微生物的生長,最終使土壤酶的活性降低[26-29]。雖然亞熱帶杉木人工林土壤養分有退化趨勢,LR減弱了生態系統土壤養分回收強度[30],但根據前人的研究結果表明土壤養分缺乏可能會刺激微生物分泌更多胞外酶來獲取限制性養分來彌補植物和微生物得生長,而在本研究中,與CK相比, LR處理后土壤SOC含量減少不顯著,并未刺激微生物分泌更多的胞外酶,但LA處理后的土壤SOC顯著提高,而且酶活性與土壤SOC含量呈正相關,土壤酶活性在LA處理下表現出顯著的促進作用,說明了LA可能通過提高SOC的輸入量來促進土壤微生物的生長和繁殖,最終導致土壤酶活性提高[31],但LR處理可能改變其他養分的輸入影響微生物活性。

本研究中,腐殖質層N/P在LR處理中顯著增加,而LA處理顯著降低。結果表明在腐殖質層中,LR處理下,土壤微生物主要受P限制,而LA處理下的土壤微生物主要受到N限制。這是因為凋落物移除顯著降低P的輸入量,相反,凋落物添加顯著增加土壤SOC和TP含量,但不改變TN,所以導致微生物可利用N減少,進而受到N限制。但是LR處理下的P水解酶和LA處理下的N水解酶活性及化學計量比間均為表現顯著差異,這與假設(1)不符,這可能是因為微生物分泌的胞外酶的相對活性可能同時受土壤養分條件和微生物本身元素組成的共同影響,后者可能占主導地位[40],因此單純從土壤酶活性角度可能不足以很好地反映土壤養分狀況。另外,土壤酶活性隨土層的加深呈逐漸下降的趨勢,這與吳傳敬等[41]研究結果一致。可能的解釋為土壤腐殖質層聚集了較多的動植物殘體的分解物,營養源豐富,水熱和通氣狀況也相對較好,為微生物生長和繁殖提供良好的環境,促使腐殖質層土壤酶活性較高[42],而隨著土層的加深,土壤養分含量均逐漸下降,養分供應的減少導致微生物生長受到限制,最終土壤酶活性降低。本研究可為亞熱帶杉木人工林土壤質量評估提供一定的參考依據。

3.2 凋落物添加和移除處理下土壤生態酶化學計量特征

土壤酶化學計量比是指示土壤微生物養分限制的重要因子[1],本研究發現,在LR和CK處理下0—5cm和5—10cm土層中土壤酶活性比ln(BG+CB):In(AP)和ln(NAG+LAP):ln(AP)均低于全球尺度上土壤酶活性比ln(BG+CB):In(AP)(0.62)和ln(NAG+LAP):In(AP)(0.44)[8],說明亞熱帶杉木人工林0—10cm土層微生物受到磷限制,這與大多數研究結果一致,以往研究通常認為熱帶和亞熱帶區域磷是生態系統生產力的主要限制因子[43]。在本研究中,LA處理下的土層土壤酶活性比ln(BG+CB):ln(AP)和ln(NAG+LAP):ln(AP)均高于相應全球酶化學計量比,表明凋落物添加在一定程度上緩解了土壤磷限制,而長期的凋落物移除處理因為磷歸還量減少,最終加劇了土壤磷的限制。該差異表明磷可能是驅動土壤生態酶化學計量比內在的聯系的關鍵因子[44]。另外,從本研究發現土壤含水量與ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)間存在顯著的負相關關系,而與ln(NAG+LAP):ln(AP)間呈正相關關系,這表明土壤含水量的提高會加劇土壤微生物N限制,從而導致土壤微生物產生合成更多分解N的NAG 和LAP酶,最終使土壤水解氮酶活性提高。該結果與袁萍[45]的研究結論一致。可能解釋為土壤水分的有效性通常制約了微生物活性和土壤有機底物酶的有效性,從而改變了生態酶化學計量比[46]。以往研究還表明,土壤生態酶化學計量能夠有效地衡量微生物對C、N和P養分的需求[47]。在本研究中我們發現土壤ln(BG+CB):ln(AP)和ln(NAG+LAP):ln(AP)均與SOC和有效氮含量間均呈顯著的正相關關系,說明 SOC和有效氮含量增加,能夠促進土壤微生物合成更多的C和N水解酶。這與Waring[48]關于土壤有效性養分會影響微生物養分利用效率而改變微生物酶活性的結果一致,也與喬航等[49]發現SOC可能是限制土壤酶化學計量比的關鍵因子研究結果一致。由于土壤養分化學計量僅反映土壤養分現狀,而土壤酶化學計量比可以表征微生物養分利用現狀,在本研究中,ln(BG+CB):ln(AP)和ln(NAG+LAP):ln(AP) 與土壤C/P和N/P呈極顯著正相關,而ln(BG+CB):ln(NAG+LAP)與土壤 C/N間無相關關系,表明了土壤酶化學計量與土壤元素計量比存在一定的對應關系,這與本文科學假設基本(2)一致,但與Xu等[50]研究結果不一致。可能是土壤養分比土壤環境因子(如：溫度、水分)對生態酶化學計量的影響更為強烈,從而加強了生態酶化學計量比和土壤化學計量比之間的聯系[51-52]。

4 結論

杉木人工林生態系統中凋落物添加和移除后的土壤C、N、P水解酶活性與對照處理間存在顯著差異。土壤C、N、P水解酶活性隨土層深度的加深而降低。亞熱帶地區杉木人工林土壤受 P限制,而凋落物添加在一定程度上緩解了土壤磷限制,相反,凋落物移除因降低磷歸還量,可能加重了土壤磷缺乏。該差異表明磷可能是驅動土壤生態酶化學計量比內在聯系的關鍵因子。土壤SMC、SOC和有效氮含量是驅動土壤酶活性和改變酶化學計量比的關鍵因子,表明生態酶化學計量比可作為表征土壤當前養分有效性狀況的重要指標,因此,在杉木人工林經營管理過程中,應長期注重水分、SOC和土壤氮磷有效性的管理。本研究結果可為亞熱帶杉木人工林土壤養分管理和可持續經營提供科學的理論依據。

致謝：感謝中國科學院千煙洲生態試驗站對野外工作的幫助。