金蕎麥提取物對膝骨關節炎模型大鼠氧自由基的影響

潘朝旺，楊家林，輯丹菊，萬進軍

（鄂州職業大學 醫學院，湖北 鄂州436099）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是在力學和生物學等因素的共同作用下，軟骨組織正常分解和合成代謝失衡，導致軟骨細胞死亡、基質降解、軟骨組織破壞的一種系統性疾病，目前其確切病因仍不明確，近年來研究提示OA的發生發展與氧自由基關系密切[1-2]，發生在膝關節的骨關節炎稱為膝骨關節炎。本課題組之前在金蕎麥對膝骨關節炎兔作用的研究中，提示其對膝骨關節炎兔關節軟骨有保護作用[3]，為了進一步探討其對骨關節炎的作用，本研究擬通過觀察金蕎麥提取物對膝骨關節炎模型大鼠血清、關節液及關節軟骨超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化脂質（LPO）的影響，探討其治療膝骨關節炎作用。

1 材料

1.1 動物

SD大鼠60只，清潔級，體重200±20g，購自成都達碩實驗動物研究中心，許可證號:SCXK(川2013-24)。

1.2 藥物與試劑

金蕎麥提取物（每g相當于原藥材20g），購自西安草翠芯生物科技有限公司；抗骨增生膠囊，江蘇康緣藥業股份有限公司。SOD、MDA、LPO ELISA試劑盒，購自上海拜力生物科技有限公司。木瓜蛋白酶,購自西安正東生物科技有限公司。

1.3 儀器

9602A酶標儀，南京普朗醫用設備有限公司；UV754紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；臺式冷凍離心機，上海安亭科學儀器公司；Z160M微量高速離心機，德國HERMLE。

2 方法

2.1 動物造模及分組給藥

取大鼠60只，隨機挑選10只作為正常組，其余50只參照文獻[4]制備骨關節炎模型：分別在第1、4、7天于大鼠雙側后肢膝關節腔內注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2mL/肢，每天1次。將模型動物隨機分為5組，每組10只，即模型組、抗骨增生膠囊組、金蕎麥低、中、高劑量組，加上前面的正常組共6組。最后一次注射木瓜蛋白酶后，給藥，金蕎麥低、中、高劑量組每天灌胃金蕎麥提取物0.135、0.270、0.540g/kg，抗骨增生膠囊組每天灌胃抗骨增生膠囊混懸液0.945g/kg，模型組和正常組每天灌胃生理鹽水5ml，連續給藥28天，末次給藥24小時后。觀察以下指標。

2.2 ELISA法檢測血清SOD、MDA、LPO

末次給藥24h后，將大鼠用3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，腹總動脈取血約8mL/只，離心，制備血清。按試劑盒說明采用ELISA法測定SOD、MDA、LPO含量。

2.3 ELISA法檢測關節液SOD、MDA、LPO

參照文獻[4]，將膝關節逐層分離至關節囊，通過反復活動膝關節，將關節液擠壓至髕上囊內側，關節腔內注入0.5mL生理鹽水，抽取關節液。按試劑盒說明采用ELISA法測定SOD、MDA、LPO含量。

2.4 ELISA法檢測軟骨組織SOD、MDA、LPO

取關節軟骨，剪碎，用生理鹽水1:20勻漿。按試劑盒說明采用ELISA法測定SOD、MDA、LPO含量。

2.5 數據統計

數據用spss19.0軟件進行統計處理，各實驗組數據均采用均數±標準差（±S）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用T檢驗。

3 結果

3.1 各組血清SOD、MDA、LPO比較

與正常組比較，模型組血清SOD含量明顯下降，而MDA、LPO明顯升高，差異有極顯著意義（P＜0.01）；與模型組比較，抗骨增生膠囊組、金蕎麥各劑量組血清SOD含量明顯升高，MDA、LPO明顯下降（P＜0.05或 P＜0.01），其中抗骨增生膠囊組、金蕎麥高、中劑量組差異有極顯著意義（P＜0.01），金蕎麥低劑量組差異有顯著意義（P＜0.05）。另外，金蕎麥高、中劑量組對SOD、MDA、LPO的調節作用優于抗骨增生膠囊組，金蕎麥中劑量組作用弱于高劑量組，但效價強度高于高劑量組，是3個劑量的最優選擇。見表1。

表1 各組血清 SOD、MDA、LPO 比較（±S，n=10）

表1 各組血清 SOD、MDA、LPO 比較（±S，n=10）

注：與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01（下同）

組 別 劑量（g/kg） SOD （U/mL） MDA （nmoL/mL） LPO （nmoL/mL）正常組模型組抗骨增生膠囊組金蕎麥低劑量組金蕎麥中劑量組金蕎麥高劑量組生理鹽水生理鹽水0.945 0.135 0.270 0.540 113.54±28.45images/BZ_108_1265_1501_2309_1522.png53.38±14.58 84.62±19.30images/BZ_108_1244_1677_2288_1698.png76.43±18.41images/BZ_108_1244_1764_2288_1785.png93.84±24.36images/BZ_108_1244_1850_2288_1871.png98.28±22.52images/BZ_108_1244_1937_2288_1958.png6.46±2.09 15.24±3.80 8.80±3.19 10.68±4.19 8.75±3.13 8.22±3.34

3.2 各組關節液和關節軟骨組織SOD、MDA、LPO比較

同上述血清SOD、MDA、LPO相似，與正常組比較，模型組關節液和關節軟骨組織SOD含量明顯下降，而MDA、LPO明顯升高，差異有極顯著意義（P＜0.01）；與模型組比較，抗骨增生膠囊組、金蕎麥各劑量組關節液和關節軟骨組織SOD含量明顯升高，MDA、LPO明顯下降（P＜0.05或 P＜0.01）。金蕎麥各劑量中，中劑量組仍是效價強度最高。見表 2、表 3。

表2 各組關節液 SOD、MDA、LPO 比較（±S，n=10）

表2 各組關節液 SOD、MDA、LPO 比較（±S，n=10）

組 別 劑量(g/kg） SOD(U/mL） MDA(nmoL/mL） LPO(nmoL/mL）正常組模型組抗骨增生膠囊組金蕎麥低劑量組金蕎麥中劑量組金蕎麥高劑量組生理鹽水生理鹽水0.945 0.135 0.270 0.540 24.43±5.30images/BZ_108_1240_2677_2266_2697.png8.54±2.20 16.06±4.22images/BZ_108_1240_2849_2266_2869.png13.82±4.53images/BZ_108_1240_2934_2266_2954.png18.86±5.70images/BZ_108_1240_3019_2266_3039.png20.32±5.46images/BZ_108_1240_3104_2266_3124.png0.67±0.23images/BZ_108_1615_2677_2641_2697.png2.80±0.70 1.61±0.63images/BZ_108_1615_2849_2641_2869.png1.95±0.64images/BZ_108_1615_2934_2641_2954.png1.10±0.26images/BZ_108_1615_3019_2641_3039.png0.98±0.22images/BZ_108_1615_3104_2641_3124.png0.59±0.18 1.85±0.34 0.97±0.26 1.24±0.49 0.78±0.21 0.72±0.23

表3 各組膝關節軟骨組織SOD、MDA、LPO比較（±S，n=10）

表3 各組膝關節軟骨組織SOD、MDA、LPO比較（±S，n=10）

組 別 劑量（g/kg） S0D （U/mg） MDA （nmoL/mg） LP0 （nmoL/mg）正常組模型組抗骨增生膠囊組金蕎麥低劑量組金蕎麥中劑量組金蕎麥高劑量組生理鹽水生理鹽水0.945 0.135 0.270 0.540 4.48±0.69 8.76±0.90 6.04±0.53 7.38±0.74 5.35±0.72 5.06±0.83

4 討論

OA作為常見于中老年人的慢性退行性關節病損，嚴重影響了人們的生活質量。目前，臨床上對于本病也沒有治愈的明確方法，原因是其具體的發病機制還不是十分清楚。已有的研究表明，生物應力、激素代謝、先天遺傳因素，金屬原子、氧化應激（自由基）、炎癥因子等因素被認為與OA發病原因及病理發展密切相關[5]。

在上述因素中，氧化應激是OA發生發展的非常重要因素，它可以通過調節胞外基質的合成和降解、細胞內信號通道的傳導、基因的轉錄和翻譯、細胞衰老和凋亡等過程，促進OA病情的發展。而氧自由基是氧化應激導致OA軟骨細胞損傷、衰老和凋亡的直接原因。氧自由基參與了維持細胞糖酵解的氧化還原平衡，從而維持關節軟骨細胞代謝的動態平衡[6]。關節組織細胞微環境里穩態平衡的氧自由基，對于維持其結構和功能具有重要作用[7]，但是，如果氧自由基代謝失衡，過量的氧自由基會導致軟骨細胞代謝失衡，抑制軟骨基質蛋白多糖和膠原的合成，加速軟骨基質的降解，引起細胞損傷。氧自由基作用于細胞脂膜，使多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，產生LPO，LPO通過正反饋攻擊生物膜導致惡性循環的細胞膜損傷，并誘使連鎖增殖反應，形成降解產物MDA[8]，故LPO和MDA均為氧自由基引起脂質過氧化的產物，故二者是檢測氧自由基水平的常用指標，它們含量的高低反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度，間接反映骨關節炎的嚴重程度。SOD是氧自由基的清除劑，它的活力反映機體清除氧自由基的能力，從而保護損傷軟骨組織，減緩軟骨破壞，其濃度越高，表明骨關節炎損傷越小。本研究表明，OA病變過程中含量存在著氧自由基代謝的紊亂，金蕎麥提取物可明顯提高膝骨關節炎大鼠血清、關節液和軟骨組織SOD含量，降低LPO、MDA的含量，改善氧自由基代謝平衡，減輕氧自由基對軟骨組織的損傷，從而保護軟骨組織。