藥用植物金花葵ISSR反應體系建立與優化

周偉 包曉華 何陳林

摘要 ? ?本試驗以藥用植物金花葵為研究材料，對金花葵ISSR反應體系進行優化。結果表明，最優體系為dNTP濃度為0.10 mmol/L、Taq酶濃度為0.25 U、引物濃度為0.20 mmol/L、Mg2+濃度為0.40 mmol/L、DNA濃度為50 ng;反應步驟為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，40次循環，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃條件下保存。本試驗建立的金花葵ISSR反應體系具有穩定性好、清晰度高、多態性豐富等優點，可為今后金花葵遺傳多樣性研究奠定試驗基礎。

關鍵詞 ? ?金花葵;ISSR;體系優化

中圖分類號 ? ?S567.21+9 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）17-0043-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

金花葵（Abelmoschus manihot（Linn.）Medic），又名金芙蓉、野芙蓉、菜芙蓉、黏干或山榆皮等，多年生錦葵科秋葵屬植物，植株高大可達2 m，適應性特別強。2003年8月被中國農業科學院在河北邢臺地區發現，屬于瀕危藥用植物，目前在河南、河北、山西、吉林等地區人工種植，每年5月種植，7—9月為花期，果實成熟為10月。金花葵含有豐富的營養物質，包括黃酮、VE、氨基酸以及金絲桃苷等活性物質，具有較高的藥用價值和保健作用。其葉片、鮮果以及莖桿含有豐富的氨基酸、微量元素和雌性激素，對于減輕或避免中老年更年期、延長女性青春期有突出效果。金花葵中黃酮的含量高達6%，比大豆的黃酮成分含量高出幾十倍，具有鎮痛、抗免疫、抗氧化、解熱抗炎等多種藥理活性。金花葵盛夏開花，具有無限開花結果習性，花大如盤，花徑15～20 cm，可種植于庭院或花園供觀賞，花中含有豐富的金絲桃苷成分，具有保肝、心腦血管保護以及抗炎作用[1]。歷版《中國藥典》以及衛計委部頒藥品標準對于金花葵均未記載，鑒于金花葵有如上藥用價值，應對其有效成分、生物活性進行深入研究，針對潛在價值深入挖掘。

ISSR是加拿大學者Zietkiewicz等人于1994年提出的，該技術是在一種簡單重復序列基礎上發展起來的新型分子標記，以錨定的微衛星DNA為引物，在SSR序列的3′端或5′端加錨2～4個隨機核苷酸，在PCR反應中，錨定引物可以引起特定位點退火，導致與錨定引物互補的間隔不太大的重復序列間DNA片段進行PCR擴增[2]。本試驗對金花葵ISSR反應體系進行了優化，以期為今后金花葵分子研究奠定基礎。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

金花葵種子及其植株。

1.2 ? ?DNA的提取

利用無錫百泰克生物技術有限公司生產的PlantGen DNA Kit植物基因組DNA提取試劑盒對金花葵新鮮葉片進行提取。

1.3 ? ?基因組DNA的質量檢測

取適當DNA原液將其稀釋后，再量取5 μL DNA稀釋溶液，然后再加入1 μL 6×Loading buffer（30 mmol/L EDTA，36%（體積比）甘油，0.05%（質量體積比）二甲苯氰，0.05%（質量體積比）溴酚藍），攪拌混勻后，小心加入點樣孔，以免膠被戳破，并且在第1個膠孔內點入6 μL DL 2000 DNA Marker作為分子量的標準，檢測DNA濃度用1×TAE，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓調節至3 V/cm，膠板在凝膠成像儀上觀察并拍照。

1.4 ? ?初始反應體系

本試驗初始反應體系見表1。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸10 min，40個循環，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃保存。以此為基礎進行ISSR參數優化研究。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?DNA純度檢測

金花葵葉片中含有大量營養物質，包括蛋白質、糖類以及維生素等，為DNA提取增加了難度，試驗提取金花葵的DNA純度高、亮度好、無降解，可完全滿足后續試驗的要求（圖1）。

2.2 ? ?引物濃度

引物濃度大小對于擴增結果影響很大，若引物濃度過大可能會出現背景模糊不清或者重演性較差等不良現象。本次試驗共設置了4個濃度梯度，分別為0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L。從圖2可以看出，濃度為0.20 mmol/L時效果最優，條帶多且清晰;濃度為0.10 mmol/L和0.15 mmol/L時擴增條帶少，多態性差;0.25 mmol/L時無擴增條帶出現。

2.3 ? ?Mg2+濃度

因為Taq DNA聚合酶對于Mg2+有較強的敏感度，并且還會有引物、擴增產物以及模板DNA等結合，擴增模板的數量也會受到Mg2+的影響。本次試驗共設置了4個濃度梯度，分別為0.30、0.35、0.40、0.45 mmol/L。從圖3可以看出，濃度為0.40 mmol/L時電泳效果最優，條帶清晰均勻且多;濃度為0.35、0.45 mmol/L時條帶較少，豐富性較差;濃度為0.30 mmol/L時條帶不清晰，背景模糊。

2.4 ? ?dNTP用量

dNTP作為PCR反應的原料，其用量直接影響產物的產量、特性及合成的忠實性。本試驗共設置4個濃度梯度，分別為0.08、0.10、0.12、0.14 mmol/L。從圖4可以看出，濃度為0.10 mmol/L時，條帶豐富性較好且較為清晰，效果最優;濃度0.08、0.12、0.14 mmol/L時條帶不清晰，多態性較差。

2.5 ? ?DNA用量

DNA模板量也是影響擴增效果的主要因素之一。模板量過低，無擴增產物或產物少而不穩定;模板量過高，又會導致擴增條帶的模糊和非特異性產物的出現。本試驗設置4個濃度梯度，分別為50、60、70、80 ng。從圖5可以看出，濃度在50 ng時，帶數最多;在濃度60～80 ng時，出現帶數少且模糊不清。因此，最優的濃度為50 ng。

2.6 ? ?Taq酶用量

Taq酶用量直接影響擴增反應成功與否，使用高濃度Taq酶易產生非特異擴增產物，但如果Taq酶濃度過低，則會導致產物合成效率下降。本試驗共設置4個濃度梯度，分別為0.15、0.20、0.25、0.30 U。從圖6可以看出，濃度為0.30 U時，條帶清晰且均勻重演性好，為最優選擇;濃度為0.25 U時，條帶分布不均勻;當濃度為0.15 U、0.20 U時，條帶較少。

3 ? ?結論與討論

雖然 ISSR標記是一種隨機標記，但是在一定條件下是相對比較穩定的，進行ISSR-PCR體系優化是十分有利的，因為得到適合該物種的反應程序和最佳體系，影響ISSR擴增的因素有很多，幾乎組成反應程序和最佳體系中的每個因子都可以影響擴增的效果[3-4]。因此，要獲得較清晰、穩定、可重復的條帶，對于ISSR-PCR反應體系的各種影響因子（包括Taq酶、dNTP、Mg2+、引物濃度、模板濃度）進行試驗是非常必要的。

在進行PCR擴增反應時，引物與模板結合后在Taq酶的作用下開始進行延伸，Mg2+對于Taq DNA聚合酶有依賴性作用，受Mg2+濃度的影響，而Mg2+與dNTP產生拮抗作用，各種因素濃度過高或過低，對擴增產物的質量都會產生影響，從而引起錯配和非特異性產物的擴增，以至于增加引物二聚體的形成概率[5-6]。本研究最終建立金花葵ISSR最佳反應體系：在20 μL的反應體系中，dNTP濃度為0.10 mmol/L，Taq酶濃度為0.25 U，引物濃度為0.20 mmol/L，Mg2+濃度為0.40 mmol/L，DNA濃度為50 ng。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸1 min，40次循環，72 ℃最后延伸10 min，4 ℃條件下保存。通過對金花葵進行ISSR體系建立與優化，加深了對瀕危植物金花葵的理解與研究，為今后利用分子標記技術對金花葵種質資源進行鑒定、分子標記輔助育種和遺傳多樣性研究等奠定了理論基礎。

4 ? ?參考文獻

[1] 唐曉清，王金羽，王寶華，等.金花葵引種及高產栽培試驗[J].吉林農業，2018（15）：88.

[2] 楊詩婷，王曉倩，廖廣輝.金絲桃苷的藥理作用機制研究進展[J].中國現代應用藥學，2018，35（6）：947-951.

[3] 盧丹，賈瑞波.中藥金花葵的研究進展[J].中國藥物評價，2015，32（2）：90-92.

[4] 張蕾，嚴萍，韓正洲，等.兩面針ISSR-PCR反應體系的建立及優化[J].廣州中醫藥大學學報，2012，29（1）：70-74.

[5] 孫葉，趙國琦，袁媛，等.96份中、日春蘭資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].分子植物育種，2020，18（5）：1535-1547.

[6] 蔡芷辰，劉訓紅，王程成，等.金銀花分子生物學研究進展[J].中國中藥雜志，2020，45（6）：1272-1278.