黃柏枝皮抑菌活性成分提取工藝及其穩定性研究

馬 欣,馬蓉麗*,成 妍,張增帥,郭俊花

1.運城職業技術大學健康學院,山西 運城 044000

2.山西農業大學園藝學院,山西 太原 030032

番茄枯萎病是番茄中最具破壞性的疾病之一，嚴重制約著番茄的生產。由于化學農藥的濫用，導致該病菌抗藥性日益增加，造成土壤嚴重污染，因此，開發環境友好、多重防治機制共同作用的植物源農藥顯得尤為重要。植物源農藥具有環境友好、對非靶標生物安全、不易產生抗藥性、作用方式特異、促進作物生長并提高抗病性、種類多、開發途徑多等特點[1]，這正符合人類可持續發展的要求，也滿足現在人們對無公害、綠色食品的要求。我國中草藥品種豐富，將具有抑菌作用的中草藥應用于病蟲害的防治，是實現農藥減量增效、保障農產品有效供應和質量安全的重要途徑。目前陸續有報道證實許多不同種類的中草藥提取物具有抗真菌活性[2]，如苦豆子、黃芩、花椒、陰香等對瓜果腐爛、蔬菜土傳病害具有較強的抑制作用[3-6]。黃柏是蕓香科植物，其干燥樹皮為常用中藥，目前主要應用于醫藥領域，而其具有抗菌、抗氧化等藥理活性，在抑制植物真菌病害方面也發揮著顯著作用。筆者曾研究發現黃柏提取物對番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici）的抑菌活性高達90%[7]，溫室防治效果可達73.53%，顯著高于常規化學藥劑[8]。在前期研究基礎上，本文以黃柏提取物對番茄枯萎病菌的抑菌效果為指標，對提取工藝進行優化，并對其抑菌穩定性進行研究，為進一步研究黃柏抑菌活性成分和抑菌作用機制奠定基礎，為新型植物源殺菌劑的開發和推廣提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃柏 供試中藥黃柏（Phellodendron chinenseSchneid.）屬蕓香科，購于山西省運城市中藥市場，使用枝皮部位。

1.1.2 供試菌種和培養基 番茄枯萎病病原菌（Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici）分離自發病番茄的根部，由馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基28 ℃下繼代培養，置于在4 ℃冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 黃柏抑菌活性物質提取方法的篩選研究（1）超聲波水提取。將陰干的黃柏材料在45 ℃恒溫電熱鼓風干燥箱中吹干至發脆，用植物粉粹機將材料粉碎，過80 目篩后備用。稱取樣品干粉50 g，用100 mL 的蒸餾水浸泡，攪拌使溶劑完全浸沒中草藥材料，置于避光處靜置24 h 后，室溫80 HZ條件下超聲輔助提取45 min，減壓抽濾得濾液，殘渣再次采取同樣方法進行處理，重復提取3 次，合并3 次濾液。將濾液用旋轉蒸發儀40 ℃條件下減壓濃縮至無溶劑蒸出（呈浸膏狀），然后用蒸餾水定容至106mg/L，密封標記后置于4 ℃冰箱中保存備用。（2）超聲波輔助醇提取。將陰干的黃柏材料在45 ℃恒溫電熱鼓風干燥箱中吹干至發脆，用植物粉粹機將材料粉碎，過80 目篩后備用。稱取樣品干粉50 g，用70%的乙醇按6：1（mL：g）的液固比浸泡，攪拌使溶劑完全浸沒中草藥材料，置于避光處靜置24 h 后，在45 ℃，80 HZ 的條件下超聲輔助提取30 min，減壓抽濾得濾液，殘渣再次采取同樣方法進行處理，重復提取三次，合并三次濾液。將濾液用旋轉蒸發儀40 ℃條件下減壓濃縮至無溶劑蒸出（呈浸膏狀），然后用50%的乙醇定容至106mg/L，密封標記后置于4 ℃冰箱中保存備用。（3）水煮提取。將陰干的黃柏材料在45 ℃恒溫電熱鼓風干燥箱中吹干至發脆，用植物粉粹機將材料粉碎，過80 目篩后備用。稱取樣品干粉50 g，加入10 倍量蒸餾水浸泡30 min，加熱至沸騰文火保持30 min，減壓抽濾得濾液，向殘渣中加入8 倍量蒸餾水采取同樣方法進行處理，重復提取三次，合并三次濾液。濾液經80 ℃恒溫水浴濃縮至106mg/L，密封標記后置于4 ℃冰箱中備用。（4）索氏提取法。將陰干的黃柏材料在45 ℃恒溫電熱鼓風干燥箱中吹干至發脆，用植物粉粹機將材料粉碎，過80 目篩后備用。稱取樣品干粉50 g，用濾紙包實后置于250 mL 索氏抽提器中，加入100 mL 95%的乙醇提取3 次，提取時間分別為3 h、2 h、1 h，減壓抽濾得濾液，將濾液用旋轉蒸發儀40 ℃條件下減壓濃縮至無溶劑蒸出（呈浸膏狀），然后用50%的乙醇定容至106mg/L，密封標記后置于4 ℃冰箱中保存備用。（5）黃柏提取物抑菌活性的離體測定。采用生長速率法進行抑菌活性的測定，取一定量上述供試藥液于PDA 培養基中混合均勻制成濃度為30 mg/mL 的帶藥培養基，倒入培養皿中，待培養基凝固后，用內徑6 mm 的打孔器在菌落邊緣生長旺盛區域打取菌餅，然后用接種針挑至培養皿中心處，每皿一個菌餅，每處理重復3 次。以混有50%乙醇的PDA 培養基作為對照。置于28 ℃恒溫培養箱中培養。當對照組菌落生長至充滿培養皿約80%時，采用十字交叉法測量供試病菌的菌落直徑，計算生長抑制率。

菌落直徑(mm)=測量菌落直徑平均值-6.0

抑菌直徑(mm)=對照菌落直徑-處理菌落直徑

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.2.2 黃柏抑菌活性物質提取工藝條件的單因素試驗 采用超聲波輔助醇提取法。選取超聲波提取時間、液固比［乙醇的體積（mL）與原料黃柏的質量（g）之比］、乙醇濃度、提取溫度4 個因素，進行單因素實驗，每個因素取5 個值，以抑菌圈直徑作為考核指標，測定黃柏提取物對番茄枯萎病菌的抑菌活性，每處理重復3 次。

1.2.3 黃柏抑菌活性物質提取工藝條件的正交優化試驗 在單因素試驗基礎上，選擇超聲波提取時間、液固比、乙醇濃度、提取溫度為考察因素，以黃柏提取物對番茄枯萎病菌的抑菌直徑為實驗指標，設計L9(34)正交優化試驗，得到黃柏抑菌活性物質的最佳提取工藝。

1.2.4 黃柏提取物抑菌穩定性試驗 取黃柏枝皮干粉100 g，在最佳提取工藝條件下提取，經旋轉蒸發濃縮至浸膏狀，用50%的乙醇定容至106mg/L，將該提取液作為原液進行以下穩定性試驗[9-11]。

（1）熱處理對黃柏提取物抑菌穩定性的影響。取上述原液分別置于40、60、80、100 ℃和121 ℃條件下密封處理30 min，高溫處理采取水浴加熱，121 ℃采取濕熱處理，以抑菌圈直徑作為考核指標，測定不同溫度處理下提取物的抑菌活性，以未加熱處理的樣品作為對照，每處理重復3 次。

（2）pH 對黃柏提取物抑菌穩定性的影響。用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 將PDA 培養基pH分別調至5、6、7、8、9，PDA 滅菌后，取上述原液制成濃度為30 mg/mL 的帶藥培養基，以未調節pH 的培養基作為對照，測定不同pH 處理下提取物的抑菌活性，每處理重復3 次。

（3）紫外照射對黃柏提取物抑菌穩定性的影響。取上述原液置于紫外燈（功率30 W）下分別照射5、15、25、35、45 min，以未經紫外照射處理的樣品作為對照，測定不同紫外照射處理條件下提取物的抑菌活性，每處理重復3 次。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法對黃柏提取物抑菌效果的影響

采用不同方法制備的黃柏枝皮提取物對番茄枯萎病菌進行抑菌活性離體測試，結果表明，對相同質量樣品干粉采用不同的提取方法表現出不同的抑菌效果，且在0.05 水平上存在顯著差異，其中，超聲波輔助醇提取法制備的黃柏提取物抑菌活性最強，抑菌率達80.19%，其他方法制備的提取物抑菌效果均不理想，抑制作用不到50%，而水煮法的抑菌效果最差，抑菌率僅有10%。這一結果說明，超聲波輔助醇提取法是制備黃柏抑菌活性成分的最佳提取方法。

表1 4 種不同提取方法對黃柏提取物抑菌效果的影響Table 1 Effects of 4 different extraction methods on antifungal activity of Phellodendron chinense

2.2 超聲波輔助醇提取法不同工藝條件對黃柏提取物抑菌效果的影響

2.2.1 超聲波提取時間 選取超聲波提取時間分別為10、20、30、40、50 min，其他條件設置為液固比6：1、乙醇體積分數70%、提取溫度45 ℃，觀察不同提取時間對黃柏提取物抑菌效果的影響。由圖1 可以看出，隨著提取時間的延長，黃柏提取物對番茄枯萎病菌的抑制作用逐漸增強，當提取時間增加至30 min 后，抑菌效果增幅趨于平衡。因此，選取30 min 為最佳超聲波提取時間。

圖1 不同超聲波提取時間對抑菌效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on antifungal effect of Phellodendron chinense extract

2.2.2 液固比 選取液固比分別為2：1、4：1、6：1、8：1、10：1，其他條件設置為提取時間30 min、乙醇體積分數70%、提取溫度45 ℃，觀察不同液固比對黃柏提取物抑菌效果的影響。由圖2 可以看出，隨著液固比的增加，黃柏提取物的抑菌效果呈現先增強后下降的趨勢，當液固比為6：1 時，抑菌效果最強，抑菌圈平均直徑達到60.6 mm，抑菌率達到80.2%。可見在一定范圍內，增大液固比，降低溶質濃度，可有效增加傳質推動力，提高提取速度[12]，促進提取物中有效抑菌成分的浸出，從而提高抑菌效果，但液固比過大會增加超聲波破碎細胞的阻力，使細胞破碎程度下降，同時非抑菌成分會浸出增多，從而降低抑菌有效成分的提取率，導致抑菌效果降低[13]。因此，綜合各因素，選取6：1為最佳液固比例。

圖2 不同液固比對抑菌效果的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratios on antifungal effectivity of Phellodendron chinense extract

圖3 不同乙醇濃度對抑菌效果的影響Fig.3 Effects of ethanol concentrations on antifungal effectivity of Phellodendron chinense extract

2.2.3 乙醇濃度 選取乙醇體積分數分別為40%、50%、60%、70%、80%，其他條件設置為提取時間30 min、液固比6：1、提取溫度45 ℃，觀察不同乙醇濃度對黃柏提取物抑菌效果的影響。由圖3 可以看出，乙醇體積分數在40%～70%范圍內，抑菌效果逐漸增加，其中在40%～60%之間呈線性增長，在乙醇體積分數為60%時，抑菌效果明顯，抑菌率已達到接近80%，之后增幅不大趨于平衡，然后隨著乙醇濃度的提高，抑菌效果又有下降趨勢，這可能是由于乙醇濃度過高，會引起溶劑與抑菌物質的極性變化，從而導致抑菌活性成分的溶解度降低[14]。因此，選取60%為最佳乙醇濃度。

2.2.4 提取溫度 選取提取溫度分別為15、30、45、60、75 ℃，其他條件設置為提取時間30 min、液固比6：1、乙醇體積分數70%，觀察不同提取溫度對黃柏提取物抑菌效果的影響。由圖4 可以看出，當溫度低于45 ℃時，隨著溫度的升高，抑菌作用顯著增強，當溫度高于45 ℃時，抑菌圈直徑差異不顯著，且趨于平衡，這說明黃柏提取物的抑菌活性成分具有較好的熱穩定性。因此，選取45 ℃為最佳提取溫度。

圖4 不同提取溫度對抑菌效果的影響Fig.4 Effects of extraction temperatures on antifungal effectivity of Phellodendron chinense extract

2.3 黃柏抑菌活性物質提取工藝條件的正交優化試驗

根據單因素試驗結果，應用正交試驗優化黃柏抑菌活性物質提取工藝的主要參數，正交試驗因素與水平設計見表2。通過對表3 正交試驗結果中極差值分析得出，各因素對抑菌效果的影響次序為C＞B＞A＞D，乙醇濃度對抑菌效果的影響作用最大，是主要因素，其次是液固比、超聲波提取時間、提取溫度，最佳提取條件為C3B2A2D2，即乙醇濃度70%、液固比6：1、提取時間30 min、提取溫度45 ℃。按此最優條件制備黃柏提取物，進行3 次重復試驗驗證，得到抑菌圈直徑的平均值為61.38 mm，抑菌效果高于試驗號5 的結果。

表2 正交優化試驗因素與水平設計Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment design

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal experiment results

2.4 黃柏提取物抑菌穩定性研究

2.4.1 熱處理對黃柏提取物抑菌穩定性的影響 不同溫度處理后黃柏提取物對番茄枯萎病菌的抑菌效果如圖5 所示。結果表明，經40～100 ℃高溫處理與未經加熱處理的提取物相比，抑菌效果在0.05水平上不存在顯著差異，抑菌圈直徑無明顯變化，抑菌率均維持在80%左右。經121 ℃濕熱處理后，抑菌圈效果顯著降低，這可能是高溫加熱處理使黃柏提取物的抑菌活性成分發生化學變化，從而導致抑菌活性降低[15]，但抑菌率仍維持在70%以上，仍具有較高的抑菌活性。這說明黃柏提取物的抑菌活性物質具有良好的耐熱性。

2.4.2 pH 對黃柏提取物抑菌穩定性的影響 由圖6 可知，經不同pH 處理的黃柏提取物對番茄枯萎病菌的抑菌作用存在顯著差異。在未調節pH 的培養基條件下，提取物的抑菌圈直徑最大為61.02 mm，抑菌率達到81.5%，抑菌效果最強；隨著介質pH 的升高或降低，提取物的抑菌作用都顯著下降，這可能是由于酸性或堿性環境破壞了黃柏提取物中抑菌活性物質的結構或者活性[10]；但當pH＞7 時，隨著介質pH 的升高，抑菌率的下降幅度逐漸趨于穩定，且在不論酸性或堿性環境下抑菌率仍維持在70%左右，說明黃柏提取物在酸堿環境下都可以保持一定的抑菌活性，對酸堿有一定的耐受性。

圖5 溫度對黃柏提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effects of temperatures on antibacterial activity of Phellodendron chinense extract

圖6 pH 對黃柏提取物抑菌活性的影響Fig.6 Effect of pH on antibacterial activity of Phellodendron chinense extract

圖7 紫外線照射時間對黃柏提取物抑菌活性的影響Fig.7 Effect of ultraviolet on antibacterial activity of Phellodendron chinense extract

2.4.3 紫外照射對黃柏提取物抑菌穩定性的影響 不同時間的紫外線照射對黃柏提取物抑菌活性的影響見圖7。如圖所示，與未經紫外線照射處理的提取物相比，經紫外線照射15 min 后，提取物的抑菌作用顯著下降，但之后隨著紫外線照射時間的延長，抑菌率基本保持不變，維持在77%以上，這說明黃柏提取物在紫外線照射下具有良好的穩定性，并在自然環境中保持較好的抑菌活性。

3 討論

經本試驗得到的超聲波輔助醇提取法最佳工藝參數結果與呂君一[16]等的報道不一致，尤其是液固比參數差別最大，本試驗液固比為6：1 遠遠低于呂君一[16]等的報道，而降低液固比會節約大量的試劑、能量和時間，同時會減小超聲波破碎細胞阻力，提高有效抑菌活性成分的提取率。研究還發現，黃柏提取物在過酸過堿環境下，或經過121 ℃高溫處理，或經過紫外線長時間照射，抑菌效果都會顯著下降，這一結果與劉艷芳[15]等報道的生物堿提取液的抑菌穩定性變化趨勢基本一致，而生物堿是黃柏的主要有效成分，且含量最高，因此可初步推測黃柏提取物中對番茄枯萎病菌起抑制作用的主要活性成分可能是生物堿，此推測有待今后進一步證實。另外，即使在不利環境條件下，提取物仍可保持較高的抑菌活性，抑菌率維持在70%以上，說明黃柏作為植物源殺菌劑在田間應用具有良好的穩定性和應用前景。本研究結果為研究開發該植物源殺菌劑的生產工藝和實現規模化生產提供了科學依據，為其在田間的應用提供理論支持，但黃柏提取物對番茄枯萎病菌的有效抑菌活性成分、抑菌作用機制以及大田防治效果還有待進一步的研究。

4 結論

4.1 超聲波輔助醇提取法是制備黃柏抑菌活性成分的最佳提取方法

超聲波輔助醇提取法所制備的提取物抑菌活性最強，與常規提取方法相比具有顯著差異，通過重復性試驗可知，采用該法提取黃柏抑菌活性物質的工藝比較穩定，重復性好，抑菌率維持在70%以上，且提取效率高、提取速度快、操作簡單是應用于黃柏抑菌有效成分提取分離的一種最佳手段。

4.2 超聲波輔助醇提取法的最佳工藝參數優化

采用單因素和正交試驗，優化超聲波輔助醇提取法的最佳工藝參數為乙醇濃度70%、液固比6：1、提取時間30 min、提取溫度45 ℃。經驗證試驗表明，在此最佳工藝條件下，黃柏提取物的抑菌效果最強，抑菌圈直徑平均值為61.38 mm，抑菌率達80%以上。

4.3 黃柏提取物抑菌活性成分具有良好的穩定性

經121 ℃高溫處理或當環境pH＜5 或pH＞11 時或經紫外線照射45 min 后，黃柏提取物的抑菌率仍維持在70%以上。黃柏提取物對高溫、過酸過堿環境、長時間紫外線照射均具有一定的耐受性。