銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 細胞成脂代謝的影響

卜 素,薛 泉,袁春穎,陳 穎,曹福亮

1.南京林業大學生物與環境學院,江蘇 南京 210037

2.南京林業大學南方現代林業協同創新中心,江蘇 南京 210037

肥胖癥是一種慢性疾病，且會引起高血壓、心腦血管疾病、慢性炎癥和癌癥等多種并發癥，且發病率正逐年提高[1,2]。脂肪細胞是人體脂肪組織內的一種重要細胞，具有儲存能量、支持緩沖、提供產熱的作用。但脂肪細胞數量的過度增加，前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化引起胞內脂質的過度積累而導致的體積增大會導致肥胖癥的發生[3]。脂肪沉積被認為是肥胖發展的關鍵步驟，控制這一步驟將能夠有效地控制肥胖的進程[4]。

3T3-L1 細胞是一種分離自小鼠胚胎的前脂肪細胞，能夠特異性分化為成熟脂肪細胞，是一種國際公認的研究細胞脂質代謝的模式細胞[5]。在3T3-L1 前脂肪細胞的分化過程中，多種轉錄因子和酶在脂質的生成和代謝中起重要作用。當轉錄因子CAAT 增強子結合蛋白α（CAAT-enhancer-bindingprotein α，C/EBPα）[6]、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）[7]和固醇調節元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c）[8]被激活后，位于其下游的一些與脂肪合成相關的酶和蛋白被激活，胞內的脂質開始積累[9]。其中，乙酰輔酶A羧化酶1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1）是脂肪酸合成第一階段的關鍵限速酶，能夠促進長鏈脂肪酸的合成，用于合成甘油三酯和磷脂[10]，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FASN）是一種催化脂肪酸合成的關鍵酶，催化丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A生成長鏈脂肪酸[11]、葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT-4）主要存在于脂肪細胞和肌肉細胞中，在受到胰島素刺激后，由胞內轉移到細胞膜上進行葡萄糖轉運[12]、脂滴包被蛋白（lipid droplet-associated protein A，Perilipin A）是一種細胞分化后期覆蓋于脂滴表面，防止脂質被胞內脂肪酶水解的重要蛋白[13]，以上都是脂質合成過程的關鍵酶和蛋白。

銀杏（Ginkgo biloba）作為一種藥食同源的植物，在我國已有數千年的利用歷史，上世紀六七十年代，德國科學家Willmar Schwabe 首先開發了一種銀杏葉提取物（EGB761），對其主要活性成分的含量都做出了規定，其中銀杏黃酮的含量不低于24%，銀杏內酯的含量不低于6%，銀杏酚酸的含量小于0.001‰。EGB761 被證明具有抗氧化、抗衰老和保護心腦血管等藥理作用[14-17]。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界的一種化合物[18]，EGB 中三種主要黃酮類成分是槲皮素、山奈酚和異鼠李素，它們也存在于很多天然植物中，且具有多種生物活性[19-21]。研究證實，銀杏葉提取物對3T3-L1前脂肪細胞有一定的增殖抑制作用[22-24]，但是其中主要活性單體對3T3-L1 細胞脂質積累的影響和機理還未得到充分闡述。抑制脂肪組織中脂肪細胞的數量增多（細胞增殖）和體積增大（細胞分化和脂質積累）是肥胖防治中的重要靶點之一。本研究將系統評估EGB 中三種銀杏黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞增殖以及成脂分化方面的影響，并檢測對成脂分化起關鍵作用的轉錄因子及相關基因在轉錄水平上的變化，為后續深入闡明銀杏黃酮調控脂質代謝的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

3T3-L1 前脂肪細胞株購自美國菌種保存中心（ATCC）；槲皮素、山奈酚和異鼠李素購自上海同田生物科技有限公司；DMEM 培養基、DPBS 磷酸鹽緩沖液、0.25%含EDTA 胰酶、青霉素和鏈霉素雙抗和胎牛血清購自美國Gibco 公司；噻唑藍（MTT）、胰島素（Insulin）、地塞米松（DEX）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）和油紅O 粉末購自美國Sigma 公司；RNA 提取試劑盒（MiniBEST Univrsal RNA Extraction Kit）、逆轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Master Mix）、qPCR 試劑盒（TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ）購自日本TaKaRa 公司；多功能酶標儀（FilterMax F5）購自美國Molecular Devices、實時熒光定量PCR 儀（Step One Plus）購自美國Applied Biosystems 公司，引物由南京擎科生物有限公司合成。

1.2 3T3-L1 前脂肪細胞的培養和誘導分化

在DMEM 培養基中加入10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗使其終濃度分別為100 U/mL和100 μg/mL，于37 ℃、5%CO2和一定濕度的條件下培養3T3-L1 細胞。在細胞長滿2 d 后，加入細胞分化液一（DMEM 高糖培養基、10%胎牛血清、1%雙抗、10 μg/mL 胰島素、1 μmol/L DEX、0.5 mM IBMX）誘導分化3 d。3 d 后換用細胞分化液二（DMEM 高糖培養基、10%胎牛血清、1%雙抗、10 μg/mL 胰島素）繼續誘導分化2 d，2 d 后換用分化液三（DMEM 高糖培養基、10%胎牛血清、1%雙抗）繼續培養，每2～3 d 換液至分化結束[25]。

1.3 MTT 法檢測三種黃酮對3T3-L1 細胞活性的影響

當3T3-L1 前脂肪細胞在96 孔板中的融合率達到70%時，換用含有不同濃度（0.5、1、10、25、50 和100 μmol/L）三種黃酮（槲皮素、山奈酚、異鼠李素）的DMEM 低糖培養基（10%胎牛血清，1%雙抗）培養處理細胞24 h。處理結束后，在每孔中加入50 μL 濃度為1 mg/mL 的MTT 溶液，在37 ℃培養箱中孵育4 h。倒去廢液，每孔加入200 μL 的DMSO 溶液，37 ℃，800 rpm 恒溫震蕩10 min，使結晶甲瓚充分溶出后，用酶標儀于595 nm 處檢測吸光值。對于成熟脂肪細胞，當3T3-L1 細胞分化為成熟脂肪細胞后，將培養基換為含有不同濃度各單體的DMEM 高糖培養基（10%胎牛血清，1%雙抗），在給藥處理24 h 后，用和前脂肪細胞相同的方法檢測吸光值[26]。細胞活力計算公式為：細胞活力=（每個樣品讀數-調零平均）/（對照組平均-調零平均）×100%

1.4 油紅O 染色及脂質積聚半定量檢測

細胞分化過程中，在換分化液二和分化液三時，同時分別添加50 μmol/L 的槲皮素、山奈酚和異鼠李素直至細胞分化結束。用PBS 清洗細胞2 次后，用10%的甲醛水溶液固定細胞1 h，后用濃度為0.3 mg/mL 的新鮮配制的油紅O 染色液與超純水按照3：2 的比例混勻，配制成油紅O 工作液，對固定好的細胞進行染色。室溫染色2 h，用蒸餾水洗去浮色并拍照[27]。拍照結束，加入異丙醇溶解細胞中的油紅O，吸出溶解液，在酶標儀中于510 nm 處測定吸光值[28]，給藥組和對照組（未經給藥處理）吸光值的比值（%）為細胞內脂質積聚的半定量結果。

1.5 逆轉錄和實時熒光定量

按照試劑盒說明提取對照組和分化過程中給藥組3T3-L1 細胞的RNA，用微量分光光度計測定RNA 的濃度和純度。按照試劑盒說明書進行逆轉錄（20 μL 體系，500 ng RNA，37 ℃45 mins，85 ℃1 min），合成cDNA。qPCR 按照20 μL 的反應體系進行。反應條件如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環。采用相對定量法（ΔΔCT）進行數據分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參計算目的基因的表達量變化（2-ΔΔCT）[29]。熒光定量引物序列見表1。

1.6 統計分析

采用統計軟件Excel 對實驗結果進行分析，結果以均值±標準差表示，每個實驗都進行了3 次重復。數據經過t檢驗分析，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結果與分析

2.1 EGB 中三種黃酮對3T3-L1 細胞活力的影響

圖1 銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞的增殖抑制影響Fig.1 Inhibitory effect of three flavonoids in Ginkgo biloba extract on the proliferation of 3t3-l1 preadipocytes

圖2 銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 成熟脂肪細胞的毒性影響Fig.2 Cytotoxicity of three flavonoids from Ginkgo biloba extract on 3T3-L1 mature adipocytes

2.2 EGB 中三種黃酮對3T3-L1 細胞分化過程中胞內脂質積累的影響

如圖1，前脂肪細胞的MTT 結果顯示，山奈酚(Kae)和槲皮素（Que）在100 μmol/L 的條件下，對細胞的增殖起一定的抑制作用；異鼠李素(Iso)則在0～100 μmol/L 的處理條件下對前脂肪細胞的增殖基本沒有影響；在低濃度處理條件下，三種銀杏黃酮則對前脂肪細胞的增殖幾乎沒有抑制作用。說明3T3-L1 前脂肪細胞的增殖受三種銀杏黃酮的影響不大，僅山奈酚和槲皮素在高濃度（100 μmol/L）下有一定的抑制作用。如圖2，成熟脂肪細胞的MTT 結果顯示，山奈酚對成熟脂肪的毒性呈梯度依賴，當給藥濃度越高，表現出的細胞毒性越大，100 μmol/L 濃度的山奈酚處理后，細胞毒性達到44%；異鼠李素僅在100 μmol/L 的濃度下表現出了14%的細胞毒性；槲皮素在0.5 μmol/L 和100 μmol/L 的條件下表現出了較高的細胞毒性，細胞毒性分別為21%和25%。異鼠李素和槲皮素在實驗中的其余濃度下細胞毒性不明顯。因此，高濃度的槲皮素、異鼠李素和山奈酚對成熟脂肪細胞有一定的細胞毒性，且山奈酚的細胞毒性較大。但槲皮素在微量濃度下也具有一定的細胞毒性，其具體作用機制暫不明確，還需要進一步的研究來證明其具體作用機制。

如圖3，經過三種銀杏黃酮處理的3T3-L1 細胞，其與對照組相比，細胞內脂滴的數量明顯減少，細胞的分化狀態較差，只有少部分的細胞成功分化。如圖4，油紅半定量結果顯示：在相同的濃度下（50 μmol/L），異鼠李素對細胞脂質積累的抑制效果最明顯（43%），山奈酚次之（29%），槲皮素的作用效果較弱（17%），且都有統計學意義。以上結果提示，三種銀杏黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞的分化均起抑制作用，且在相同濃度下對脂質積累的抑制程度各不相同。

圖3 三種銀杏黃酮處理后3T3-L1 細胞的油紅O 染色結果（200×）Fig.3 Oil Red O staining results of 3t3-l1 cells treated with three ginkgo flavones（200×）

圖4 銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞成脂分化的影響Fig.4 Effects of three flavonoids in Ginkgo bilobaextract on adipogenic differentiation of 3t3-l1 preadipocytes

2.3 EGB 中三種黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞分化中轉錄因子mRNA 水平的影響

如圖5，槲皮素、山奈酚和異鼠李素在低濃度（0.5 μmol/L）和較高濃度（50 μmol/L）給藥的條件下都能顯著降低C/EBPα的表達水平，其相對表達量都為對照組的10%左右，且均具有統計學意義。如圖6，槲皮素和異鼠李素在低濃度時對轉錄因子PPARγ的影響不明顯，山奈酚在0.5 μmol/L 時，對PPARγ的表達有一定的促進作用，但無統計學意義；但在50 μmol/L 濃度給藥時，槲皮素和山奈酚能夠較明顯地抑制PPARγ的表達。如圖7，三種黃酮在低濃度時對SREBP-1c 的表達量影響不大，在50 μmol/L 的濃度下，對SREBP-1c 有一定的抑制作用，其中槲皮素和異鼠李素有相近的抑制效果，山奈酚的抑制效果較次。以上結果表明，三種銀杏黃酮在低濃度下對轉錄因子C/EBPα的抑制作用明顯，而對PPARγ和SPEBP-1c 的抑制作用不明顯；在較高濃度下，三種銀杏黃酮對C/EBPα、PPARγ和SPEBP-1c 這三個轉錄因子的表達均能顯著地抑制其表達。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primer sequence of real-time fluorescence quantification PCR

圖5 銀杏葉提取物三種黃酮對轉錄因子C/EBPα的影響Fig.5 Effect of three flavonoids inGinkgo bilobaextract on C/EBPα

圖6 銀杏葉提取物三種黃酮對轉錄因子PPARγ的影響Fig.6 Effect of three flavonoids inGinkgo bilobaextract on PPARγ

圖7 銀杏葉提取物三種黃酮對轉錄因子SREBP-1c的影響Fig.7 Effects of three flavonoids fromGinkgo bilobaextracton

2.4 EGB 中三種黃酮對成脂基因表達量的影響

如圖8，與對照組相比，槲皮素和異鼠李素在0.5 μmol/L 的低濃度下，對ACC1 的表達有少許促進作用，山奈酚在此濃度下對ACC1 的表達影響不大，然而在50 μmol/L 的濃度下，三種銀杏黃酮對ACC1 的表達都表現出了一定的抑制作用。如圖9 和10 所示，三種銀杏黃酮處理后FASN 和GLUT-4 的表達都下調，且三種黃酮對GLUT-4 基因表達的抑制作用都呈現劑效關系。如圖11，槲皮素對Perilipin A 的表達起抑制作用，0.5 μmol/L 濃度的山奈酚對Perilipin A 的表達起一定的促進作用，異鼠李素對其表達沒有明顯影響。以上結果提示，三種銀杏黃酮在50 μmol/L 較高濃度下，均能夠通過下調ACC1 和FASN 的表達來抑制胞內脂肪酸的合成，同時能夠通過下調GLUT-4 的表達來減少細胞對外界葡萄糖的轉運，從而減少胞內脂質合成的能量來源。槲皮素能夠下調Perilipin A的表達，減少對胞內脂滴的保護作用，此結果提示槲皮素可能對胞內脂質的水解有促進作用，而山奈酚和異鼠李素不能抑制Perilipin A 的表達。在0.5 μmol/L 的低濃度下，ACC1 的表達未被抑制，說明在該濃度下，三種銀杏黃酮對脂肪酸的從頭合成無顯著影響。

圖8 銀杏葉提取物中三種黃酮對ACC1 的影響Fig.8 Effects of three flavonoids in Ginkgo biloba extract on ACC1

圖9 銀杏葉提取物主要黃酮對FASN 的影響Fig.9 Effects of main flavonoids in Ginkgo biloba extract on FASN

圖10 銀杏葉提取物主要黃酮對GLUT-4 的影響Fig.10 Effect of Three Flavonoids in Ginkgo biloba extract on GLUT-4

圖11 銀杏葉提取物主要黃酮對Perilipin A 的影響Fig.11 Effect of main flavonoids in Ginkgo biloba extract on Perilipin A

3 討論

肥胖是一種全球范圍內發病率不斷增高的慢性疾病[30-32]，前脂肪細胞的增殖和脂肪細胞中脂質的增加是導致肥胖癥發病的主要原因，因此，抑制前脂肪細胞的增殖和改善脂肪細胞中的脂質代謝是治療肥胖的兩個主要的方向。有研究表明，銀杏葉提取物對3T3-L1 前脂肪細胞的增殖有抑制作用，但是其主要活性單體的作用和機理還未得到詳盡的闡述。

C/EBPα和PPARγ是調控3T3-L1 前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的關鍵轉錄因子，在細胞分化的終末期大量表達。C/EBPα和PPARγ兩者存在相互作用的關系，PPARγ的表達會誘導C/EBPα的表達[33]。轉錄因子SREBP-1c 對FASN 的激活起著重要作用，SREBP-1c 表達量的上調會促進FASN 的合成，以促進細胞內脂質的積累[34]。GLUT-4 是位于細胞膜上的葡萄糖轉運蛋白，C/EBPα、PPARγ和SREBP-1c 均可與其啟動子結合以激活其表達[35]。

ACC1 在脂肪細胞中大量表達，催化生成的丙二酰輔酶A 是長鏈脂肪酸合成和延伸的重要C2底物，是影響3T3-L1 細胞脂質代謝的關鍵蛋白[36,37]。Perilipin A 則是細胞分化終末期的脂滴包被蛋白，對分化終末期脂質的積累起重要作用，能夠將胞內的脂滴包裹起來，避免胞內的脂肪水解酶的水解以維持胞內脂質代謝的平衡偏向脂質積累[38]。

本研究的實驗結果表明，山奈酚和槲皮素都對前脂肪細胞的增殖有一定的抑制作用，山奈酚對成熟脂肪細胞表現出濃度依賴的細胞毒性，槲皮素對成熟脂肪細胞具有沒有劑量關系的細胞毒性，而異鼠李素在僅在高濃度時對成熟脂肪細胞有細胞毒性。在mRNA 水平，三種黃酮在較高濃度處理后，均會下調3T3-L1 細胞分化過程中關鍵轉錄因子的表達水平，尤其是C/EBPα，其相對表達量僅為對照組的10%左右，并由此導致這些轉錄因子下游與脂質積聚相關蛋白和酶的基因表達也受到一定的抑制。三種黃酮在較低濃度時，對其下游的抑制作用表現不明顯。異鼠李素在50 μmol/L 的較高濃度下，通過抑制C/EBPα、SREBP-1c、ACC1、FASN 和GLUT-4 的表達來抑制胞內的脂質合成和細胞分化進程。槲皮素與山奈酚在mRNA 層面與異鼠李素有類似的作用效果，且在高濃度時二者能夠下調轉錄因子PPARγ的表達，同時槲皮素還對Perilipin A 的表達也有較好的抑制效果。在細胞水平，三種黃酮對3T3-L1 前脂肪細胞分化過程中脂質的積累都起到了一定程度的抑制作用。綜上所述，槲皮素、異鼠李素和山奈酚這三種銀杏黃酮能夠抑制3T3-L1 細胞的成脂分化，但其抑制效果和抑制方式各不相同。本結果初步評估了銀杏葉提取物中三種黃酮對3T3-L1 脂肪細胞脂質代謝的影響，深入的作用機制和對肥胖癥的影響還需要進一步的實驗來證明。

4 結論

本研究系統評估了銀杏葉提取物中三種黃酮——山奈酚、異鼠李素和槲皮素對3T3-L1脂肪細胞成脂代謝的影響。結果表明三種銀杏黃酮對3T3-L1細胞的主要影響方式是對成熟脂肪的細胞毒性、較高濃度時對前脂肪細胞的增殖抑制、以及下調主導脂肪細胞分化的轉錄因子及脂質生成相關基因的表達。三種黃酮對3T3-L1細胞的成脂分化作用各有不同，我們推測在銀杏葉提取物中，黃酮類組分通過協同效應達到改善脂質代謝和脂質過度積累的效果，同時提示杏葉提取物在肥胖的預防治療中具有潛在的價值。