中國(guó)海南坡壘炭疽病病原鑒定

譚祥豐,劉君昂,周國(guó)英*

1.中南林業(yè)科技大學(xué),湖南 長(zhǎng)沙 410004

2.南方人工林病蟲害防控國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410004

3.森林有害生物防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410004

4.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長(zhǎng)沙 410004

海南坡壘（Hopea hainanensisMerr.et Chun）是中國(guó)海南省熱帶雨林中生長(zhǎng)的代表性鄉(xiāng)土珍貴樹種，是人們生產(chǎn)生活重要的木材來源。坡壘樹通常生長(zhǎng)在濱水區(qū)和溝渠中，高度可達(dá)20～30 m[1]。這種樹在溫暖潮濕的環(huán)境中長(zhǎng)勢(shì)更好，樹冠枝層最為茂密[2]。近年來，人們對(duì)海南省熱帶珍貴樹種的研究更為細(xì)致深入，并深入研究了其他龍腦香科植物的地理分布和生長(zhǎng)范圍[3,4]。集中的坡壘種植區(qū)通常會(huì)發(fā)現(xiàn)有大量幼苗[5]，而幼苗的生長(zhǎng)與環(huán)境的濕度、溫度及林層高度等相關(guān)因素密切相關(guān)[6]。

坡壘又是一類比較特殊的熱帶樹木[7]，并且在與之同一科屬的相關(guān)樹種開發(fā)和利用中顯示出巨大的潛力[8]。坡壘是一種常綠喬木，會(huì)開花，其花顏色鮮艷極其吸引人，因此被視為是觀賞樹木。海南熱帶雨林中，野生的坡壘樹相對(duì)較少。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，在海南只發(fā)現(xiàn)了幾百棵野生環(huán)境中生長(zhǎng)的坡壘樹[9]。雖然野生型坡壘非常罕見，但卻非常經(jīng)久耐用，在當(dāng)?shù)剡m合做漁輪的外龍骨，亦可作碼頭樁材、橋梁和其它建筑用材等。此外，野生坡壘不太容易受一般蟲害的影響。這些因素使坡壘成為許多處于熱帶和亞熱帶國(guó)家極受歡迎的建筑用材因此，已對(duì)坡壘樹種實(shí)施具體保護(hù)[3]。雖然海南坡壘通常不存在嚴(yán)重蟲害，但還是存在著有幾種病害（例如，褐色葉斑病和葉尖枯萎?。?huì)危害海南坡壘的葉片。這些病害發(fā)生在大面積坡壘種植區(qū)，可能會(huì)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

本研究目標(biāo)是確定在中國(guó)海南澄邁林場(chǎng)觀察到的炭疽病的病原體。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)中國(guó)海南坡壘的炭疽病的報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 材料

病害樣本：新鮮的坡壘炭疽病病葉（三片，編號(hào)分別為PLCM010-1，PLCM010-2，PLCM010-3）和健康的坡壘嫩葉。采集點(diǎn)：海南科大林業(yè)有限公司基地。

1.2 病原菌分離與純化

使用滅過菌的不銹鋼手術(shù)刀在超凈工作臺(tái)上切取病葉上病斑與健康組織交界處部分[10]，用75%乙醇對(duì)樣品表面進(jìn)行消毒并用無菌水漂洗3 次后，置于馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂（PDA）培養(yǎng)皿，并在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)7 d，篩選出待純化菌株。然后再將待純化的菌株轉(zhuǎn)移至新的PDA，恢復(fù)菌絲生長(zhǎng)進(jìn)而產(chǎn)生純培養(yǎng)物。

1.3 分離菌株形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定

將菌株P(guān)LCM010 置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)適宜的時(shí)間，待其產(chǎn)孢后，根據(jù)常規(guī)形態(tài)特征將研究中收集的真菌分離株進(jìn)行初步鑒定[11]，觀察其病原菌菌落、菌絲及分生孢子的形態(tài)特征。使用真菌DNA 提取試劑盒，從這些純培養(yǎng)的PDA 平板中提取真菌基因組DNA，從而進(jìn)一步鑒定病原菌。然后，用合適的引物對(duì)分別為internal transcribed spacer[12](ITS：ITS4/ITS5)，partial sequence of glyceraldeyde-3-phosphate dehydrogenase-like gene[13](GAPDH：GDF1/GDR1)，actin gene[14](ACT：ACT-512F/ACT-783R),and beta-tubulin gene[15,16](TUB2：TUB2-T1/Bt-2b)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。之后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（110 V，40 min），回收目的條帶，送至擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。使用NCBI BLAST 軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）[17]比較測(cè)得序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)序列。下一步，根據(jù)最大簡(jiǎn)約法[18,19]使用MEGA7 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4 致病性測(cè)定

將分離純化后的菌株培養(yǎng)7 d 后接種到健康的離體坡壘嫩葉上，再將接種后的離體坡壘嫩葉置于25 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)5～7 d 后，觀察。

2 結(jié)果與分析

自然生長(zhǎng)7 d 后的培養(yǎng)基表面菌落平均直徑為7.4～7.6 cm。分生孢子為單胞，整體呈現(xiàn)圓柱狀，兩端無色且鈍圓。在菌落上所觀察到的菌絲看起來極其致密，表面蓬松，中心呈灰色，邊緣呈白色，背面呈白色至深灰色[20]（圖1）。其中：a) 一株受感染的坡壘植物。b) 侵染炭疽病的葉片。c)PDA培養(yǎng)皿上的菌落。d)分生孢子，比例尺=50 μm。e) 附著胞，比例尺=10 μm。

圖1 炭疽病Fig.1 Anthracnose disease

測(cè)序后的序列上傳到GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)分別為MN841836、MT439332、MT439334 和MT439333，炭疽病侵染早期通常表現(xiàn)為灰色病變[20]，就該分析而言，大于50%的MP 自舉支持值均顯示在最終的系統(tǒng)發(fā)育樹中。將Monilochaetes infuscans作為該分析的外群，并使用最大似然法進(jìn)行這項(xiàng)基于ITS、GAPDH、ACT和TUB2基因序列進(jìn)行組合矩陣分析，生成果生炭疽菌MP 系統(tǒng)發(fā)育樹。大于50%的MP 自舉支持值均顯示在此系統(tǒng)發(fā)育樹中，結(jié)果圖2 所示，比例尺=20 nucleotide substitutions。本研究中的分離株用黑色菱形標(biāo)記。從圖2 可以看出分離純化得到的菌株與ICMP 18646和ICMP 18581 集中于系統(tǒng)發(fā)育樹的一枝[21]。

圖2 比較果生炭疽菌與其他炭疽菌屬種類之間的進(jìn)化關(guān)系的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 A phylogenetic tree comparing the evolutionary relationships between Colletotrichum fructicola and other Colletotrichum species

通過使用菌餅和分生孢子懸浮液（105個(gè)/mL）分別接種在新鮮坡壘嫩葉的有傷和無傷部分，同時(shí)用無菌水進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了這種病原菌的致病性[18]。重復(fù)五次此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，并將葉片在潮濕的25 ℃腔室內(nèi)培養(yǎng)7 d。圖3 結(jié)果顯示此后這些葉片的接種側(cè)的暗褐色病變較為明顯，而對(duì)照區(qū)域未出現(xiàn)這種病變，因此符合Koch 原則的假設(shè)。另外，還從這些葉片的接種部分再次分離果生炭疽菌，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)與最初分離株的形態(tài)相同。

圖3 致病性測(cè)定結(jié)果Fig.3 Results >of back experiment

3 結(jié)論

本研究中坡壘病葉上觀察到的病征與由果生刺盤孢炭疽菌引起的油茶炭疽病癥狀相似。再基于上述分析，根據(jù)其分子和形態(tài)特征，確定引起影響坡壘樹的炭疽病的致病性真菌為果生刺盤孢炭疽菌（Colletotrichum fructicola）[22]。據(jù)我們所知，這是第一份描述影響中國(guó)坡壘樹的炭疽病由果生炭疽菌引起的案例報(bào)告。