超高效液相色譜—四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜法快速測定草魚中7種激素

周艷華 - 李 濤 張鵬飛 -

(1. 長沙環境保護職業技術學院，湖南 長沙 410004；2. 湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410111；3. 湖南湘典食品有限公司，湖南 長沙 410031)

草魚為中國重要淡水經濟養殖魚類，年產量連續多年位居首位，水產品中藥物殘留一直是社會關注的熱點。雄激素和孕激素是類固醇激素，能影響動物性別分化，具有強而持久的蛋白同化作用，可促進動物超常態生長，大幅提高養殖經濟效益[1-2]，被廣泛應用于養殖業[3]。食用含有激素殘留的水產品會干擾人體正常激素平衡，影響人體正常代謝功能，導致發育異常，具有潛在的致癌風險以及較大的危害性[4-5]。為保障食品安全，農業部第235號公告和GB 31650—2019規定了水產品中不得檢出雄激素、孕激素類藥物殘留。

目前，雄激素、孕激素檢測主要有液相色譜法[6-7]、氣質聯用法[8-10]、液質聯用法[11-12]等。高效液相色譜法靈敏度低，檢測項目單一，定性分析易受干擾；氣質聯用法需進行衍生化反應，操作繁雜；液質聯用法具有靈敏度高、選擇好、抗干擾能力強等優點，但前處理方法繁雜，耗時較長，回收率低，而采用QuEChERS凈化工藝，可大大縮短檢測時間，提高檢驗效率。近年來，以四級桿/飛行時間質譜和四級桿/軌道阱質譜為代表的高分辨質譜技術具有高特異性、高準確度和高分辨率等優點[13]，已應用于農藥殘留[14]、獸藥殘留[15-16]及保健食品非法添加[17]等領域，但未見應用于草魚中雄激素、孕激素的檢測。

試驗擬對草魚基質中7種雄激素和孕激素類藥物殘留進行檢驗研究，優化其提取試劑與提取方法，采用QuEChERS凈化工藝替代傳統固相萃取凈化法，并應用空白基質匹配法替代內標法，采用四級桿/軌道阱高分辨質譜替代傳統液相質譜檢測7種激素，建立一種草魚中7種激素藥物殘留的快速檢測方法，并進行方法有效性研究，評價其7種激素的基質效應，旨在為利用高分辨質譜測定雄激素、孕激素的方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮草魚：市售；

Hypersil Gold C18色譜柱：150 mm×2.1 mm，3 μm，美國Thermo Fisher Scientific公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國 CNW公司；

甲酸：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司；

NH2萃取劑、C18萃取劑、HLB萃取劑：40～63 μm，60 A，德國CNW公司；

丙酸睪酮(CAS 57-85-2，純度99.7%)、甲睪酮(CAS 58-18-4，純度98.0%)、睪酮(CAS 58-22-0，純度98.5%)、勃地酮(CAS 846-48-0，純度98.5%)、諾龍(CAS 434-22-0，純度99.0%)、群勃龍(CAS 10161-33-8，純度96.3%)、孕酮(CAS 57-83-0，純度99.3%)標準品：德國Dr公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜串聯四級桿/靜電場軌道阱高分辨質譜：Q Exactive Focus型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

電子分析天平：ME204E型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速冷凍離心機：JXN-26型，貝克曼庫爾德(美國)股份有限公司；

高速振蕩器：CM-1000型，東京理化器械株式會社。

1.3 質譜條件優化

HESI離子源下，采用PRM/Targeted-MS2掃描， 掃描范圍m/z50～400，分辨率35 000，毛細管電壓3 000 V；電噴霧離子源溫度325 ℃，汽化溫度360 ℃；鞘氣壓0.24 kPa；輔助氣壓0.091 kPa；離子傳輸管溫度325 ℃；噴霧電壓4.0 kV。取標準溶液直接質譜，通過Full MS掃描確定電離模式和母離子m/z，通過SIM掃描確定定量離子和定性離子。

1.4 液相色譜條件優化

相同洗脫程序和色譜柱條件下，選擇0.1%甲酸溶液為無機流動相，甲醇、乙腈、0.1%甲酸—乙腈為有機流動相，考察分離效果。色譜柱Hypersil Gold C18(150 mm×2.1 mm，3 μm)，流動相A為無機流動相，流動相B為有機流動相；采用梯度洗脫模式(見表1)進樣；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣體積5 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.5 樣品前處理工藝優化

1.5.1 提取劑 取草魚可食用部分充分勻漿，精密稱取2.0 g于50 mL離心管中，平行樣6份，加入提取劑10 mL，振搖1 min，超聲15 min，離心，取上清液，殘渣加入10 mL提取劑，振蕩搖勻15 min，離心，合并上清液，混勻，冷凍2 h，高速冷凍離心，上清液過0.22 μm濾膜，上機測定，計算平均回收率。分別選擇甲醇、乙腈、1%甲酸—乙腈進行優化，選擇最佳提取劑。

1.5.2 凈化劑 最優提取條件下獲取樣品提取液4.0 mL，萃取劑種類選擇分別加入200 mg C18、HLB、NH2萃取劑，平行樣6份，萃取劑用量組分別加入100，200，300 mg C18萃取劑，平行樣6份，振蕩混勻，高速離心，上清液過0.22 μm濾膜，上機測定，計算平均回收率。

1.6 線性范圍、檢出限和定量限測定

取空白樣品按最優前處理工藝制備空白基質溶液，配制1.0～100.0 ng/mL基質標準溶液，以峰面積響應值為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，制作標準曲線。在空白草魚樣品中添加低濃度混合標準溶液，按樣品制備方式處理，進液質聯用儀檢測，化合物測定S/N≥3的濃度為檢出限，S/N≥10的濃度為定量限。

1.7 準確度和精密度測定

空白草魚樣品中加入7種激素混合標準溶液，加標后樣品濃度分別為2.0，4.0，20.0 μg/kg，每個濃度樣品制備6份，測定7種激素含量，計算回收率和RSD值。

1.8 基質效應評價

取空白草魚基質樣品，按最優前處理工藝處理樣品后，配制空白基質混合標準系列溶液，經液質聯用儀測定后得空白基質標準曲線，同時取溶劑配制與基質標準曲線濃度一致的溶劑標準系列溶液，經液質聯用儀測定得溶劑標準曲線[18]。根據基質標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比值來評價基質效應。

1.9 草魚樣品檢測

依據上述最優樣品前處理工藝進行處理，最優儀器條件下檢測樣品中7種激素，質譜采集數據采用保留時間進行定性，結合離子豐度比和二級特征離子進行確證。

1.10 數據處理

采用Excel軟件對試驗數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 質譜條件優化

由表2可知，7種激素在正離子模式下響應值最高，得到的化合物母離子質荷比均為[M+H]+。其中丙酸睪酮、甲睪酮、睪酮和孕酮具有相同的碎片離子，且定量與定性離子相同。

表2 7種激素的質譜參數表?

2.2 液相色譜條件優化

由圖1知，甲醇、乙腈、0.1%甲酸—乙腈均能分離7種激素，且目標物在10 min內得到了有效分離，其中0.1%甲酸—乙腈的分離效果及響應值最高。目標化合物極性小，易與C18色譜柱結合，乙腈洗脫能力強于甲醇，出峰時間更快，乙腈分離效果優于甲醇。目標化合物采用正離子模式分析，加入低濃度甲酸有利于提供正電荷，離子化效率大大提高，因此，0.1%甲酸—乙腈響應度高于乙腈。

圖1 7種激素混合標準溶液定量離子色譜圖

2.3 提取劑優化

由圖2可知，3種提取劑中，1%甲酸—乙腈提取的目標化合物回收率最高，甲醇提取的回收率最低。甲醇提取時，水溶性蛋白進入提取液影響了目標化合物的電離，回收率不高。乙腈具有沉淀蛋白作用，降低了提取液中基質的干擾，在酸性環境下更有利于雄激素和孕酮的提取。試驗采用二次提取法，充分提取了樣品中目標化合物，保證了最佳提取效果。樣品提取液冷凍后，脂肪轉換為固態，通過離心去除后可有效降低提取液中基質干擾，提高目標物回收率。

圖2 提取劑對目標物回收率的影響

2.4 凈化條件的優化

由圖3可知，3種凈化劑中，使用NH2和C18凈化后，目標化合物回收率為75%～110%，C18凈化劑凈化后回收率高于NH2；而使用HLB凈化劑后，僅丙酸睪酮回收率>60%，其他化合物回收率均<60%，表明HLB凈化劑對目標化合物有吸附作用。C18吸附劑能去除脂肪和酯類等非極性干擾物，故選擇C18凈化劑作為凈化工藝凈化劑。

圖3 吸附劑對目標物回收率的影響

由圖4可知，相同體積提取液中，當C18凈化劑用量為200 mg時，目標化合物回收率最高；當C18凈化劑用量為100 mg時，凈化劑量少而凈化效果差，目標化合物回收率最低；當C18凈化劑用量為300 mg時，目標化合物回收率低于凈化劑用量為200 mg的，表明過多的凈化劑會吸附部分目標化合物，且增加檢測成本。故C18凈化劑的最適用量為200 mg。

圖4 C18吸附劑用量對目標物回收率的影響

2.5 線性范圍、檢出限和定量限分析

由表3可知，當激素濃度為1.0～100.0 ng/mL時，7種激素線性關系良好(R2≥0.998)，檢出限為0.04～0.60 μg/kg，定量限為0.2～1.8 μg/kg，表明利用基質溶液配制標準溶液能有效降低基質增強與抑制效應，可準確檢測目標化合物含量。

表3 7種激素的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.6 準確度和精密度分析

由表4可知，當加標濃度為2.0 μg/kg時，回收率為71.4%～103.5%，RSD為4.8%～7.8%；當加標濃度為4.0 μg/kg時，回收率為79.4%～106.9%，RSD為2.4%～7.6%；當加標濃度為20.0 μg/kg時，回收率為81.0%～106.5%，RSD為4.1%～6.2%。3個梯度加標回收率和精密度良好，表明該方法具有較好的準確度和精密度，能滿足草魚實際樣品中雄激素和孕激素的檢測要求。

表4 7種激素的回收率和精密度

2.7 基質效應評價

由圖5可知，7種激素均表現為基質抑制效應，且比值均<80%，表明此方法檢測草魚中7種雄激素和孕激素呈強抑制效應。基質效應與液相串聯質譜特性相關，不能完全消除基質效應，在評估基質效應的基礎上，可通過優化樣品前處理方法、使用合適的內標、采用基質標準溶液校正等方式降低和補償基質效應，從而獲得準確的定量結果。內標法成本昂貴，試驗采用空白基質匹配標準曲線以補償基質效應。

圖5 7種激素的基質效應

2.8 實際樣品檢測

采用試驗建立的檢驗方法對市場采購的20批次鮮活草魚進行檢測，均未檢出上述7種雄激素、孕激素。

3 結論

建立了一種超高效液相色譜串聯阱高分辨質譜檢測草魚中7種雄激素、孕激素的方法，優化了前處理方法中的提取工藝與凈化工藝，建立了QuEChERS樣品處理方法，并對線性方程、檢出限、定量限、回收率等方法學指標進行了驗證。結果表明，試驗方法相較于SN/T 4744—2017和農業部1031號公告-1-2008 SPE凈化法，大大縮短了檢驗時間，降低了檢驗成本，且回收率更高，能滿足草魚實際樣品中雄激素和孕激素的檢測要求。試驗在QuEChERS樣品前處理工藝中缺少復配凈化劑研究，檢驗方法的多基質樣品適用性研究不夠。