魔芋葡甘露低聚糖的熱穩(wěn)定特性以及與低聚果糖益生元的對比分析

葉 楓，湯宏赤，張劍堡，和竹新，和正鵬，范銳鴻，林麗華，郭 媛，劉江麗，龐 浩,,*

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西科學(xué)院 國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國家重點實驗室，廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530007；3.麗江大然生物有限公司，云南 麗江 674100）

低聚糖是低分子質(zhì)量的碳水化合物，又稱寡糖，一般是由10 個以內(nèi)的單糖以糖苷鍵連接成直鏈或支鏈的聚合物，介于單糖與多糖之間，按照生理特性又可分為普通低聚糖和功能性低聚糖[1-2]。國內(nèi)外研究中，一些功能性低聚糖在促進(jìn)益生菌生長、增強(qiáng)免疫、改善腸道疾病等方面有突出作用[3-5]，這些功能性低聚糖被歸類為益生元。Gibson等[6-7]在1995年首次提出益生元的概念并在2004年對其定義進(jìn)行更新，益生元指一些不被宿主消化吸收，卻能夠選擇性地促進(jìn)體內(nèi)有益菌的代謝和增殖，從而改善宿主健康的有機(jī)物。

近年來，益生元在醫(yī)藥、飼料、食品等領(lǐng)域的應(yīng)用成為國內(nèi)外的研究熱點。在醫(yī)藥領(lǐng)域，益生元對于治療胃腸道疾病和過敏反應(yīng)具有突出作用[8-9]。在飼料中添加益生元，能夠有效促進(jìn)動物腸道有益菌的增殖、提高內(nèi)源消化酶活性、保護(hù)動物肝臟、調(diào)節(jié)脂類代謝以及降低膽固醇和血脂等[10-11]，Markowiak等[12]報道將益生元應(yīng)用于動物養(yǎng)殖中，能夠提高動物免疫狀況以及改善肉類、牛奶和雞蛋的品質(zhì)。益生元在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用最為廣泛，可應(yīng)用于面包、餅干、嬰兒奶粉、發(fā)酵牛奶和乳制品等產(chǎn)品中[13-14]。Alizadeh等[15]研究表明在嬰兒奶粉配方中添加了低聚半乳糖，通過刺激機(jī)體免疫，增加唾液和結(jié)腸中免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）的分泌量，同時促進(jìn)腸道菌群生長以及調(diào)節(jié)腸道平衡；Longoria-García等[16]將益生元作為反式脂肪的替代物應(yīng)用于烘焙食品中，避免反式脂肪的不良影響，使產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)和口感良好且具有健康腸道的功能作用。

低聚糖作為功能成分添加到藥物、飼料、食品等中，其熱力學(xué)穩(wěn)定性和分解特性成為藥物、食品等加工工藝設(shè)計的一個關(guān)注點[17-18]。目前，國內(nèi)外研究學(xué)者對于低聚糖類化合物的相關(guān)研究主要集中在對糖的分離純化、結(jié)構(gòu)解析、合成和生物活性功能等方面[19-20]，對于低聚糖的熱分解和熱穩(wěn)定性研究較少。特別是對于新型的益生元，如魔芋葡甘露低聚糖等缺乏相關(guān)熱穩(wěn)定性的分析數(shù)據(jù)。來自魔芋的葡甘露低聚糖是一種新型的益生元，是由D-甘露糖以β-1,4-糖苷鍵連接形成主鏈以及主鏈或支鏈上以β-1,3-糖苷鍵連接葡萄糖而成的水溶性多糖，主要由魔芋塊莖中葡甘聚糖降解得到，已成為國內(nèi)外市場上新型的益生元[21-22]。為探究葡甘露低聚糖和低聚果糖熱穩(wěn)定性的影響，本實驗以這兩種益生元為材料，采用Kissinger、Kissinger-Akahira-Sunose（KAS）和Flynn-Wall-Ozawa（FWO）3 種動力學(xué)分析方法對兩種益生元熱解后的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以便于后續(xù)研究工作中深入分析低聚糖化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，同時也為葡甘露低聚糖和低聚果糖在藥物和食品工業(yè)領(lǐng)域進(jìn)行配方設(shè)計和加工工藝設(shè)計提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡甘露低聚糖（聚合度2～6，純度99%） 麗江大然生物有限公司；低聚果糖（聚合度2～5，純度99%）山東保齡寶生物股份有限公司；葡萄糖（分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）有限公司；D-果糖、D-甘露糖（純度99%） 上海源葉生物科技有限公司；乙腈賽默飛世爾（上海）科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGA Q50熱重分析儀 美國TA儀器公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng) 沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低聚糖含量HPLC分析

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX NH2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為體積分?jǐn)?shù)80%乙腈，流動速率為1 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.1.2 HPLC分析

分別以超純水為溶劑配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖溶液，用超純水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%葡甘露低聚糖溶液和10%低聚果糖溶液，所有試劑通過0.22 μm的濾膜過濾，用單糖進(jìn)行標(biāo)樣，定量分析多糖中單糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每個樣品做兩次平行。

1.3.2 低聚糖熱穩(wěn)定性測定

對TGA Q50進(jìn)行溫度和質(zhì)量校準(zhǔn)。所有樣品在實驗之前進(jìn)行烘干處理，稱取適量（不高于11 mg）樣品放入帶有吊籃的Al2O3坩堝中。溫度30～600 ℃，升溫速率為5、10、15、20 ℃/min，使用高純氮氣作為保護(hù)氣，氣流速率為50 mL/min，每個樣品做兩次平行。

1.3.3 低聚糖熱分解動力學(xué)分析

固體一步熱解過程可以表示為：低分子聚糖→碳+揮發(fā)性氣體。從低分子聚糖到揮發(fā)性氣體的熱力學(xué)參數(shù)依據(jù)Arrhenius定律按公式（1）[23]計算。通常無模式函數(shù)法采用非等溫線性升溫速率β，按公式（2）計算。由公式（1）、（2）得到公式（3）。

式 中：α為 轉(zhuǎn) 化 率；A為 指 前 因 子/s-1；β為 升溫速率；E為活化能/（k J/m o l）；R為氣體常數(shù)8.314 J/（K·mol）；T為溫度/℃；t為時間/min。

轉(zhuǎn)化率α又可以按公式（4）表示。

式中：m0為樣品初始質(zhì)量/g；mt為任意t時刻樣品質(zhì)量/g；mf為樣品最終質(zhì)量/g。

采用非等溫?zé)o模式函數(shù)法[23-24]，分別用Kissinger法、KAS法和FWO法對葡甘露低聚糖和低聚果糖熱解過程進(jìn)行非等溫動力學(xué)分析。分別按公式（6）、（7）、（8）計算。

式中：Tm為微商熱重（ differential thermogravimetry，DTG）曲線峰溫；Ek、Ea和Eo分別為對應(yīng)分析方法所得的活化能。

在Kissinger法中，由于非等溫過程改變加熱速率，DTG曲線峰溫隨之改變，以ln（β/Tm2）對1/Tm作圖進(jìn)行擬合性分析，得到直線斜率后對應(yīng)-Ek/R可以計算出活化能Ek，由截距可求得指前因子A；在KAS法中，由于-與β/T2無直接聯(lián)系，而Ea是等轉(zhuǎn)化率α所對應(yīng)的表觀活化能，以ln（β/T2）對1/T作圖進(jìn)行擬合性分析，得到直線斜率后對應(yīng)-Ea/R可以計算出活化能Ea；在FWO方法中，固定轉(zhuǎn)化率α所對應(yīng)的的表觀活化能，以lnβ對1/Tm作圖擬合性分析，得到直線斜率后對應(yīng)-1.052Eo/R可以計算出活化能Eo。

1.3.4 低聚糖熱解機(jī)理的判定

由公式（8）得到公式（9）。

根據(jù)楊鵬等[25]的方法采用同一溫度所對應(yīng)的轉(zhuǎn)化率α與不同升溫速率，通過化合物熱分解最常用的30 種最概然機(jī)理函數(shù)的積分形式G（α），以lng（α）對lnβ作圖，用最小乘二法進(jìn)行線性擬合獲取線性較好且斜率接近-1所對應(yīng)的機(jī)理函數(shù)，即為該反應(yīng)的最概然機(jī)理函數(shù)，并將其帶入公式（10）得到指前因子A。

1.3.5 熱解過程動力學(xué)參數(shù)計算

根據(jù)Lei Zhihui等[26]的方法，用KAS法求得Ea和lnA后，熱力學(xué)參數(shù)焓變（ΔH）、吉布斯自由能（ΔG）和熵變（ΔS）分別由公式（11）～（13）計算。

式中：KB為波爾茲曼常數(shù)（1.381×10-23J/K）；h為普朗克常數(shù)（6.626×10-34J·s）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用TA Universal Analysis軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，利用Origin 9.0軟件處理數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低聚糖HPLC分析結(jié)果

由圖1A可知，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的D-果糖、D-甘露糖和葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，出峰時間分別在8.47、8.89 min和9.65 min左右，圖1B中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%低聚果糖和圖1C中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%葡甘露低聚糖，與圖1A中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%單糖的峰面積對比分析，結(jié)果表明兩種低聚糖中單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于1%。

圖 1 單糖與低聚糖高效液相色譜圖Fig. 1 High performance liquid chromatography analysis of monosaccharide and oligosaccharide standards

2.2 低聚糖熱重分析結(jié)果

根據(jù)程澤[27]和陳穎欽[28]等對單糖熱分解研究，由圖2A、B中DTG曲線可知，單糖的分解峰溫比低聚糖的分解峰溫低，說明單糖比低聚糖更易分解。鑒于單糖相關(guān)研究的基礎(chǔ)，本實驗主要突出比較兩種低聚糖的熱分解穩(wěn)定性。

圖 2 低聚糖和單糖的TG曲線與DTG曲線Fig. 2 Thermogravimetry and differential thermogravimetry curves of oligosaccharides at different heating rates

由圖2C、D可以看出，在不同升溫速率下兩種低聚糖的熱重（thermogravimetry，TG）曲線與DTG曲線變化的趨勢保持一致，由于熱滯后和傳熱限制的影響，TG曲線隨加熱速率的增加而橫向移動，DTG曲線的峰形越來越突出，通過最大升溫速率20 ℃/min可以看出[29]。兩種低聚糖的熱解過程大致可以分為3 個階段：第一階段，在30～100 ℃內(nèi)主要是脫去水分，由TG曲線呈現(xiàn)出微小下降，DTG曲線出現(xiàn)平峰（失水峰）；第二階段和第三階段，在160～370 ℃內(nèi)，TG曲線呈現(xiàn)大幅度下降，由DTG曲線可看出兩種低聚糖包含一個尖峰和一個單肩峰并且有部分重疊，由表1峰溫數(shù)據(jù)可知，兩個階段的峰溫值相差不大，第二階段的質(zhì)量損失速率大于第三階段的質(zhì)量損失速率，說明在第二階段低聚糖分子主要以熔融和分解體為主，葡甘露低聚糖不同分子質(zhì)量的聚合物解聚成單糖及包含少量葡萄糖的聚合物，而低聚果糖中果四糖、果五糖解聚成果二糖和果三糖，果二糖和果三糖能迅速形成結(jié)晶固體狀物[30-31]，第三階段對解聚后的產(chǎn)物進(jìn)一步分解成碳和氣體。在370 ℃之后，TG曲線和DTG曲線都呈現(xiàn)緩慢變化直至趨于平直。

表 1 不同升溫速率下低聚糖的熱解參數(shù)Table 1 Pyrolysis parameters of oligosaccharides at different heating rates

兩種低聚糖的熱解參數(shù)如表1所示，由不同速率下低聚糖熱解參數(shù)可知，兩種低聚糖的Ti和Tm隨著升溫速率的增加而升高，而Tf無明顯變化，說明兩種低聚糖的熱解溫度范圍相差不大。在所有升溫速率條件下，低聚果糖的Rmax最高，這表明低聚果糖的熱解機(jī)理相對簡單，熱分解過程相對較快[32]。在不同升溫速率下兩種低聚糖的Mf都很低，相差不大，表明Mf不受升溫速率的影響。

圖 3 不同升溫速率下低聚糖熱解過程轉(zhuǎn)化率曲線Fig. 3 Curves of α versus T of oligosaccharide pyrolysis at different heating rates

圖3為低聚糖熱解實驗得出的轉(zhuǎn)化率與溫度的曲線，隨著溫度的升高，轉(zhuǎn)化率逐漸增大，相同轉(zhuǎn)化率的條件下，升溫速率越快對應(yīng)的溫度則越高。該曲線是后續(xù)分析熱解非等溫?zé)o模式函數(shù)法的基礎(chǔ)。

2.3 低聚糖動力學(xué)分析結(jié)果

表 2 用Kissinger法和FWO法分別計算低聚糖熱分解活化能Table 2 Activation energy of oligosaccharide thermal decomposition calculated by Kissinger method and FWO method, separately

圖 4 低聚糖在不同轉(zhuǎn)化率下ln（β/T2）與1/T的曲線Fig. 4 Curve of ln (β/T2) against 1/T of oligosaccharides at different conversion rates

根據(jù)低聚糖的DTG曲線，用Kissinger、FWO法和KAS法分別對第二階段和第三階段進(jìn)行分析。根據(jù)表2可知，分別采用Kissinger法和FWO法計算得到表觀活化能Ek和Eo，Kissinger法沒有考慮機(jī)理函數(shù)以線性擬合后截距求得指前因子A，F(xiàn)WO法根據(jù)最概然機(jī)理函數(shù)求得指前因子A，兩個方法計算的結(jié)果相差不大，葡甘露低聚糖第二階段的活化能低于低聚果糖第二階段的活化能，而第三階段的活化能高于低聚果糖第三階段的活化能，表明葡甘露低聚糖第二階段更易分解，第三階段更難分解，由于計算存在誤差，為避免有誤差的可能性，取Kissinger法和FWO法的平均值作為分解的活化能以及指前因子，葡甘露低聚糖第二階段和第三階段的活化能及指前因子分別為114.73 kJ/mol、24.30 min-1和156.05 kJ/mol、32.95 min-1，低聚果糖第二階段和第三階段的活化能及指前因子分別為138.65 kJ/mol、32.03 min-1和145.92 kJ/mol、31.73 min-1。由TG-DTG曲線以及表1可知，由于需要考慮葡甘露低聚糖和低聚果糖成分的有效性，在加工、貯藏、運輸以及應(yīng)用等過程中，本實驗主要以第一個分解溫度進(jìn)行分析，保證低聚糖有效成分最大利用。根據(jù)Yang Hang等[33]的研究方法，本實驗第二階段選取α為0.15～0.95，第三階段選取α為0.05～0.60，排除線性相關(guān)性差的轉(zhuǎn)化率，并以0.05為間隔進(jìn)行分析，通過公式（9）以ln（β/T2）對1/T作圖，分別對兩種低聚糖第二階段和第三階段進(jìn)行線性擬合性分析，如圖4所示，結(jié)果表明兩種低聚糖用KAS法分析均具有較好的線性相關(guān)性，R2均大于0.97。

圖 5 KAS法在不同轉(zhuǎn)化率下獲得的低聚糖的活化能Fig. 5 Activation energy of oligosaccharides obtained by KAS method at different conversion rates

圖5為不同轉(zhuǎn)化率下用KAS法獲得兩種低聚糖活化能的對比圖，由圖5A可知，第二階段葡甘露低聚糖活化能基本保持不變，低聚果糖活化能呈上升的趨勢。Forgo等[30]的研究表明果糖的熱穩(wěn)定性不如葡萄糖和甘露糖，第二階段兩種低聚糖活化能表明低聚果糖中果二糖和果三糖迅速結(jié)晶導(dǎo)致其活化能偏高。由圖5B可知，兩種低聚糖在第一個分解峰溫之后，隨著溫度升高，聚合物進(jìn)一步解聚成單糖，為了達(dá)到第二個分解峰溫，活化能進(jìn)一步升高，結(jié)果表明葡甘露低聚糖的活化能高于低聚果糖活化能，說明葡甘露低聚糖的熱穩(wěn)定性高于低聚果糖。

2.4 低聚糖熱分解機(jī)理

表 3 低聚糖最概然機(jī)理函數(shù)擬合結(jié)果Table 3 Most probable mechanism functions of oligosaccharides

表3為葡甘露低聚糖和低聚果糖熱解機(jī)理函數(shù)擬合結(jié)果，本實驗分別以同一溫度所對應(yīng)的α值帶入最常用的30 種機(jī)理函數(shù)的積分形式G（α）進(jìn)行擬合性分析，選取斜率接近-1且擬合性較好的方程。結(jié)果表明，葡甘露低聚糖熱解反應(yīng)第二階段的機(jī)理函數(shù)為G（α）＝[1-（1-α）1/3]2，該階段的熱解機(jī)理為三維擴(kuò)散和球形對稱的Jander方程；第三階段的機(jī)理函數(shù)為G（α）＝[-ln（1-α）]4，該階段的熱解機(jī)理為隨機(jī)成核和隨后生長，遵循Avrami-Erofeev方程。低聚果糖熱解反應(yīng)第二階段的機(jī)理函數(shù)為G（α）＝1-（1-α）4；第三階段的機(jī)理函數(shù)為G（α）＝[-ln（1-α）]2，該階段的熱解機(jī)理為隨機(jī)成核和隨后生長，遵循Avrami-Erofeev方程。

2.5 低聚糖熱分解的熱力學(xué)參數(shù)

表4為兩種低聚糖用KAS法線性擬合分析，本實驗選取擬合性較好的直線斜率來獲得表觀活化能，R2均在0.98以上，根據(jù)相關(guān)熱力學(xué)公式進(jìn)行計算求得熱力學(xué)參數(shù)。葡甘露低聚糖熱解第二階段和第三階段各轉(zhuǎn)化率的Ea，平均值分別為114.42、163.77 kJ/mol，低聚果糖兩個階段的Ea分別為137.22、144.95 kJ/mol，通過與Kissinger法和FWO法分析得到的活化能進(jìn)行比較，3 種方法分析得到的Ea相差不大；葡甘露低聚糖的第二和三階段的lnA，平均值分別為26.08、34.82 min-1，低聚果糖兩個階段的lnA分別為32.02、31.83 min-1，同樣與之前兩種方法分析得到的lnA相差不大，由于實驗計算可能存在誤差，取3 個方法的平均值作為本實驗研究的結(jié)果，即葡甘露低聚糖第二階段和第三階段的Ea及l(fā)nA分別為114.58 kJ/mol、25.19 min-1和159.91 kJ/mol、33.89 min-1，低聚果糖第二階段和第三階段的Ea及l(fā) nA分別為137.94 kJ/mol、32.03 min-1和145.44 kJ/mol、31.78 min-1。Gupta等[34]研究報道稱指前因子A＜109s-1（＜20.72 min-1）表示化合物表面控制反應(yīng)，而A＞109s-1（＞20.72 min-1）表示簡單的化合物表面自由運動反應(yīng)，A值越高表示該化合物分解更慢。兩種低聚糖第二階段lnA變化不大，均大于20.70 min-1，所以兩種低聚糖不受表面控制反應(yīng)，而在第三階段兩種lnA變化較大，其中葡甘露低聚糖的lnA更大，表明葡甘露低聚糖熱解更緩慢，同時兩種低聚糖熱解機(jī)理發(fā)生的變化與表3兩階段不同熱解機(jī)理相符合。

另外，熱力學(xué)參數(shù)ΔG、ΔH、ΔS均為溫度的狀態(tài)函數(shù)。隨著溫度的升高，兩種低聚糖各階段的ΔG、ΔH均大于0，說明兩個階段的熱解反應(yīng)需要吸收大量的熱。葡甘露低聚糖第二階段ΔS均為負(fù)值，表明該過程中低聚糖的解聚分解呈有序進(jìn)行，相反，葡甘露低聚糖第三階段和低聚果糖第二、三階段ΔS均有正負(fù)值，表明葡甘露低聚糖解聚后產(chǎn)生的葡萄糖使成分熱解需要更多的熱量且更加復(fù)雜化，而低聚果糖ΔS初始階段為負(fù)值，表明低聚果糖中果三糖復(fù)合物水平增加并快速結(jié)晶呈有序性進(jìn)行。

表 4 低聚糖動力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Kinetic and thermodynamic parameters of oligosaccharides

3 結(jié) 論

本實驗采用熱重分析儀以5、10、15、20 ℃/min非等溫升溫速率，對葡甘露低聚糖和低聚果糖的熱解性質(zhì)進(jìn)行分析，兩種低聚熱解過程分為3 個階段，且分解峰溫在220～300 ℃，分別用Kissinger、KAS、FWO 3 種熱力學(xué)分析方法分析比較兩種低聚糖的熱穩(wěn)定性，第二階段低聚果糖和葡甘露低聚糖的活化能分別為137.94 kJ/mol和114.58 kJ/mol，結(jié)果表明低聚果糖中果二糖和果三糖迅速結(jié)晶導(dǎo)致其活化能偏高，第三階段低聚果糖和葡甘露低聚糖的活化能分別為145.44 kJ/mol和159.91 kJ/mol，隨著溫度進(jìn)一步升高，兩種低聚糖解聚成單糖，結(jié)果表明葡甘露低聚糖熱穩(wěn)定性高于低聚果糖。低聚果糖和葡甘露低聚糖lnA分別為32.03、31.78 min-1和25.19、33.89 min-1；分析葡甘露低聚糖和低聚果糖的熱解機(jī)理函數(shù)，第二階段和第三階段分別為G（α）＝[1-（1-α）1/3]2、G（α）＝[-ln（1-α）]4和G（α）＝1-（1-α）4、G（α）＝[-ln（1-α）]2；熱力學(xué)參數(shù)葡甘露低聚糖第二階段和三階段的ΔH為110.13 kJ/mol和159.11 kJ/mol，低聚果糖第二階段和三階段的ΔH為132.99 kJ/mol和140.46 kJ/mol。葡甘露低聚糖和低聚果糖熱穩(wěn)定性及動力學(xué)機(jī)理的比較分析，為其在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考依據(jù)。