楊桃種質果實品質性狀遺傳多樣性分析

馬小衛，蘇穆清，李棟梁，鄭 斌，鄒明宏,*

（1.中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，海南省熱帶作物營養重點實驗室，廣東 湛江 524091；2.嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048）

楊桃（Averrhoa carambolaL.）又名陽桃、三稔子、洋桃等，屬酢漿草科（Oxalidaceae）五斂子屬，多年生常綠木本果樹。因楊桃果實橫切面呈星型，又稱之為“星梨”，其成熟果實味甜、多汁、微酸，具有令人愉悅的香氣，同時具有藥用和食療價值[1-3]，是深受消費者喜愛的時令水果。楊桃原產于東南亞熱帶和亞熱帶地區，中國種植楊桃已有2 000多年的歷史，目前主要分布在廣東、廣西、福建、云南和臺灣等地[4]。在長期栽培中，由于各種植區氣候和土壤等環境條件的不同，形成了具有豐富遺傳多樣性的種質資源。在已有楊桃種質資源的研究中，主要是利用各種分子標記分析楊桃種質的遺傳多樣性[5-6]，其他文獻中，如劉勝輝等[7]研究了3 個楊桃品種果實香氣組成，朱銀玲[8]分析了楊桃葉中6 種礦質元素含量，戴子云[9]評價了19 個楊桃品種鉻的富集能力，而從種質資源角度綜合評價楊桃果實品質性狀的研究鮮見報道。針對此問題，本研究從形態、化學、營養等方面鑒定和評價楊桃種質果實品質性狀多樣性，為客觀評價及利用種質資源培育新品種，滿足市場需求提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

21 份供試種質資源來源于中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物種質資源圃（位于廣東省湛江市麻章區）。2018年9—11月，在各種質成熟期，每份種質采集15～20 個成熟果實。不同種質成熟期的確定是根據果皮的色澤和果實風味變化，并結合往年的數據記錄。

乙腈、乙醇、葡萄糖、果糖、蔗糖、酒石酸、蘋果酸、VC、檸檬酸（均為色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）有限公司；偏磷酸、硫酸、濃硝酸、高氯酸（均為分析純） 廣東西隴科學股份有限公司；NaOH（分析純） 上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ICP電感耦合等離子體發射光譜儀 日本島津公司；1100高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

果實采摘后分為三部分，一部分用于果實單果質量、縱徑、橫徑以及可溶性固形物和可滴定酸含量分析；另一部分液氮速凍后置于-70 ℃冰箱保存，用于可溶性糖和酸含量分析；其余部分置70 ℃烘箱中烘干，用于礦質元素分析。

1.3.2 果實可溶性固形物和可滴定酸含量測定

可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）用手持折光儀測定，可滴定酸（titratable acid，TA）含量采用NaOH滴定法測定。

1.3.3 果實可溶性糖和有機酸含量測定

利用高效液相色譜法分析果實可溶性糖（果糖、葡萄糖和蔗糖）和有機酸（VC、酒石酸、蘋果酸和檸檬酸）含量[10]。

可溶性糖含量測定：取1.0 g果肉加入5 mL、體積分數85%乙醇溶液研磨成勻漿后，于40 ℃水浴提取20 min后，室溫下10 000 r/min離心10 min，85 ℃水浴蒸干。用4 mL蒸餾水溶解，取1 mL過0.4 μm濾膜用于高效液相色譜分析。RI-1530示差檢測器，流速1.0 mL/min，柱溫27 ℃，進樣量10 μL，測定時間為15 min。

有機酸含量測定：取果肉樣品1.0 g，用5 mL偏磷酸（2 g/L）冰浴研磨，10 000×g離心15 min，取上清液；沉淀經4 mL偏磷酸充分洗滌后離心，取上清液；合并上清液，偏磷酸定容至10 mL。混勻后，取1 mL樣品，經0.45 μm濾膜過濾后待測。紫外檢測器測定，色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm），流動相為偏磷酸（0.2 g/L），流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL，檢測時間為30 min。

果實總糖含量為所測各可溶性糖含量之和，總酸含量為所測各有機酸含量之和。果實甜度值參照馬小衛等[11]的方法計算，如下式所示。

甜度值＝蔗糖含量/（mg/g）×1.00+果糖含量/（mg/g）×1.75+葡萄糖含量/（mg/g）×0.75

1.3.4 果實礦質元素含量測定

礦質元素含量測定參照鮑士旦[12]的方法，以硫酸消煮-火焰光度法測定鉀含量，以濃硝酸、高氯酸（4∶1，V/V）消煮-ICP電感耦合等離子體發射光譜儀測定鈣、鎂、銅、鐵、錳和鋅含量。

1.4 數據處理與分析

采用SAS 11.0軟件對數據進行單因素方差分析，相關性分析和主成分分析利用XLstat軟件。進行主成分分析（principal component analysis，PCA）前，參考馬慶華等[13]的方法利用隸屬度函數法對原始數據進行標準化，并計算各品種的綜合得分。

2 結果與分析

2.1 果實外觀表型結果

圖 1 21 份楊桃種質資源果實照片Fig. 1 Photographs of 21 carambola germplasm accessions

供試種質的外觀形狀如圖1所示，可以看出不同楊桃種質間外觀色澤及形狀變化幅度較小，所有種質均為五角形狀。21 份楊桃果實的縱徑、橫徑及果形指數（縱徑/橫徑）平均值分別為101.87、65.59 mm和1.56，變異系數分別為9.97%、10.63%和10.89%（表1）。果實縱徑最長的是‘新加坡黃肉’（123.05 mm），最短的為‘馬來西亞紅’（80.59 mm）；果實橫徑最長的為‘臺農3號’（83.87 mm），最短的為‘馬來西亞紅’（56.07 mm）。果形指數較大的是‘廣西3號’（1.95）和‘馬來西亞紅’（1.83），這些果實為長果型，果長是果寬的約2 倍；而‘臺農號’和‘臺農4號’果形指數最小，分別為1.30和1.26。

表 1 21 份楊桃種質資源果實表型特征多樣性分析Table 1 Diversity analysis of fruit phenotypic characters in 21 carambola germplasm accessions

21 份楊桃種質單果質量平均值為109.98 g，范圍在71.46～173.52 g，變異系數為19.33%。其中單果質量較大的種質有‘化州紅’（173.52 g）、‘廣西4號’（135.17 g）和‘廣西2號’（129.49 g），單果質量較小的種質是‘臺灣秤錘’（86.15 g）、‘臺農3號’（79.55 g）和‘臺農1號’（71.46 g）。2.2 果實可滴定酸和可溶性固形物含量

表 2 21 份楊桃種質資源果實SSC和TA含量多樣性分析Table 2 Diversity analysis of SSC and TA content in 21 carambola germplasm accessions

由表2可知，21 份楊桃種質SSC和TA含量的變化范圍分別是5.90～8.10 °Brix和0.28～1.92 mmol/100 g，平均值分別為7.12 °Brix和0.56 mmol/100 g，變異系數分別為7.44%和58.47%。相對于TA含量，種質間SSC的變化幅度較小。‘臺農1號’、‘廣西2號’、‘新加坡紅肉’果實SSC較高，分別為8.1、7.6 °Brix和7.6 °Brix，而‘臺農2號’和‘馬來西亞B10’果實SSC較低，分別為6.5 °Brix和5.9 °Brix。在所分析種質中，‘廣西4號’TA含量（1.92 mmol/100 g）明顯高于其他種質。大部分種質TA含量為0.41～0.67 mmol/100 g，占所有種質的76.19%；而‘臺灣秤錘’、‘馬來西亞B10’、‘新加坡紅肉’和‘臺農1號’TA含量較低。不同種質間固酸比（SSC/TA）變化幅度較小，范圍在3.70～28.57，平均值14.75，變異系數為36.94%。其中固酸比較高的種質是‘臺灣秤錘’（20.28）、‘新加坡紅肉’（25.60）和‘臺農1號’（28.57），大部分種質固酸比集中在10.50～19.00，約占所有種質的80.95%；‘廣西4號’固酸比最小（3.70），明顯低于其他種質，這和其TA含量較高有關。

2.3 果實可溶性糖和有機酸含量

表 3 21 份楊桃種質資源果實可溶性糖和有機酸性狀多樣性分析Table 3 Diversity analysis of sugars and organic acids in 21 carambola germplasm accessions

由表3可知，不同楊桃種質間總糖含量差異明顯，總糖含量變化范圍在39.82（‘臺農2號’）～61.20 mg/g（‘馬來西亞’）之間，平均值為53.22 mg/g，變異系數為10.86%。甜度值與總糖變化趨勢很相似，甜度值變化范圍在48.39～74.22，平均值為64.64。甜度值最高的3 個種質為‘馬來西亞’、‘臺農1號’和‘臺農4號’，而‘廣西1號’、‘大世紀’和‘臺農2號’甜度值較低。楊桃果實中可溶性糖以葡萄糖和果糖為主，分別占總糖的44%和47%，蔗糖含量很低，占總糖的0.08%。21 份種質葡萄糖含量在19.63（‘臺農2號’）～29.18 mg/g（‘馬來西亞’）之間，平均值為25.16 mg/g，變異系數分別為10.29%。‘臺灣3號’的果糖含量最高（27.18 mg/g），‘臺農2號’果糖含量最低（17.96 mg/g），平均值為23.62 mg/g，果糖含量變異系數為11.01%；楊桃果實蔗糖含量為0.70（‘廣西4號’）～8.54 mg/g（‘新加坡紅肉’），平均值為4.43 mg/g。

楊桃果實總酸含量變化范圍在0.93～3.76 mg/g，平均值為2.61 mg/g，變異系數為73.54%。在所分析種質中，‘廣西4號’總酸含量明顯高于其他品種，而‘臺農2號’、‘大世紀’和‘馬來西亞紅’總酸含量較低。楊桃果實有機酸以酒石酸含量最高，平均值是1.80 mg/g，占總酸的68.97%；其次是蘋果酸，其含量和所占總酸比例分別是0.49 mg/g和18.77%，其中‘廣西1號’、‘臺農1號’、‘大世紀’和‘馬來西亞紅’果實中蘋果酸含量高于酒石酸。蘋果酸酸味柔和、爽快，與檸檬酸相比刺激性緩慢，保留時間長，因此蘋果酸優勢型種質應作為楊桃種質中的優勢種質；再次是VC，占總酸的7.28%；含量最低的是檸檬酸，所占總酸比例為5.36%。

2 1 份楊桃種質的酒石酸含量變化范圍在0.15～9.03 mg/g，變異系數為109.95%，變化幅度較大；‘廣西4號’酒石酸含量最高（9.03 mg/g），其次是‘臺農4號’、‘新加坡紅肉’和‘馬來西亞’，平均含量2.87 mg/g，含量最低的3 份種質是‘馬來西亞紅’、‘實生酸’和‘臺灣軟枝’，平均含量0.19 mg/g。所測定種質中蘋果酸含量最低值是0.11 mg/g，最高值0.80 mg/g（‘臺農1號’）是最低值的7.27 倍，大部分種質含量集中在0.40～0.74 mg/g，占所有種質的71.4%；‘廣西4號’和‘臺農2號’含量較低。不同楊桃種質VC含量變化幅度較小（32.40%），范圍在0.09～0.35 mg/g；其中含量較高的種質是‘廣西4號’（0.35 mg/g）、‘臺農3號’（0.32 mg/g）和‘實生酸’（0.25 mg/g）；其余品種的含量集中在0.09～0.22 mg/g，‘新加坡黃肉’和‘馬來西亞B10’含量較低。檸檬酸含量較低，在0.02～0.50 mg/g之間，平均值為0.14 mg/g，變異系數79.07%，變化幅度較大；含量較低的種質是‘香蜜’、‘馬來西亞香蜜’、‘馬來西亞’和‘新加坡紅肉’，含量最高的種質是‘臺農1號’（0.50 mg/g）。檸檬酸酸味較強，常作為添加劑用于食品工業。檸檬酸含量較高的楊桃種質也應作為重要資源加以利用，以培育風味多樣化的品種。

以各種質的總可溶性糖含量（果糖、葡萄糖和蔗糖含量之和）與總有機酸含量（酒石酸、蘋果酸、檸檬酸和VC含量之和）進行比值計算，21 份楊桃種質糖酸比范圍在6.01～55.53，平均值29.05，變異系數為54.97%。‘馬來西亞紅’、‘大世紀’、‘臺農2號’、‘廣西1號’、‘臺灣軟枝’、‘實生酸’、‘馬來西亞B10’、‘廣西3號’、‘臺灣秤錘’和‘臺農1號’果實糖酸比較高，平均值44.03；‘廣西4號’糖酸比最低（6.01），其余種質糖酸比范圍在11.21～24.89，平均值16.38。

2.4 果實礦質元素含量

表 4 21 份楊桃種質資源果實礦質元素含量多樣性分析Table 4 Diversity analysis of minerals content in 21 carambola germplasm accessions

7 種礦質元素在21 份楊桃種質中的含量范圍、平均值、標準差、變異系數見表4。鉀、鈣和鎂是楊桃果實的主要礦質元素，平均含量分別為1.46 g/100 g、638.82 mg/kg和837.39 mg/kg；大、中量元素鉀、鈣和鎂的含量明顯高于另外4 種微量元素。在所有種質中，除‘化州紅’果實鈣含量高于鎂外，其余種質3 種元素含量排序為鉀＞鎂＞鈣。楊桃果實鐵、錳、鋅和銅含量較低，平均含量分別為152.73、89.99、27.41 mg/kg和5.12 mg/kg。在所分析樣品中，‘馬來西亞香蜜’、‘化州紅’、‘廣西2號’和‘新加坡黃肉’果實錳含量高于鐵含量，其余各種質果實4 種微量元素的含量排序為鐵＞錳＞鋅＞銅，占所有品種的80.95%。

鐵的變異系數（104.78%）明顯高于其他3 種微量元素（銅、鋅、錳），表明不同楊桃種質間Fe含量差異較大，其中‘廣西1號’（725.04 mg/kg）和‘化州紅’（492.23 mg/kg）鐵含量遠高于其他種質，這些資源可以看成是楊桃種質中的寶貴資源，作為富Fe育種的材料；‘馬來西亞B10’、‘馬來西亞香蜜’、‘馬來西亞’、‘臺灣金星’、‘臺農4號’、‘香蜜’和‘臺農2號’7 份種質鐵含量范圍在114.96～185.83 mg/kg，平均值146.16 mg/kg，占所有種質的33.33%；其他11 份種質Fe含量范圍在66.95～93.12 mg/kg，平均值80.27 mg/kg。

2.5 基于果實性狀的聚類分析和相關性分析結果

相關性分析結果表明（表5），楊桃果實各性狀之間存在復雜的正負相關性。SSC與固酸比、果糖含量、葡萄糖含量、蔗糖含量、總糖含量及甜度值之間存在極顯著的正相關關系；鋅含量與鉀、銅含量之間，錳含量與鈣、銅含量之間也存在顯著或極顯著的正相關關系；蔗糖含量與錳、鈣、銅含量及可滴定酸含量之間具有顯著或極顯著負相關關系，而與SSC和固酸比之間呈極顯著正相關；酒石酸含量與蘋果酸含量、糖酸比之間呈極顯著負相關，與VC、總酸含量分別呈顯著和極顯著正相關。

圖 2 25 項品質指標聚類圖Fig. 2 Dendrogram obtained from cluster analysis of 25 measured traits

表 5 果實品質性狀相關性分析Table 5 Correlation analysis of fruit quality traits

利用切比雪夫距離，采用Ward方法對25 項果實表型指標進行聚類分析，由圖2可知，25 項指標可以分為6 個組。第一組性狀包括VC、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、可滴定酸、總酸、鉀、銅含量和果形指數、SSC、蔗糖含量，主要反映了果實酸度；第二組性狀包括總糖含量、甜度值、果糖含量、葡萄糖含量、固酸比、糖酸比和果實橫徑，反映了果實含糖量；第三組性狀包括單果質量、果實縱徑和錳含量，反映了果實大小；第四組、第五組和第六組均包含1 個性狀，分別是鈣含量、鎂含量和鐵含量。果實性狀的聚類結果與各性狀之間的相關性分析結果一致，相關性分析和聚類分析結果可為今后開展楊桃種質資源綜合性狀評價時觀測性狀的取舍提供參考依據。

2.6 基于果實性狀的主成分分析

PCA法被用于評價各參數對果實品質變異的貢獻。對所測的楊桃果實25 個指標原始數據經隸屬函數轉化后進行PCA（表6），前兩個主成分累積貢獻率為42.13%，前6 個主成分累積方差貢獻率達到81.63%，說明這6 個主成分可以基本反映全部指標的信息，但同時也可以看出各性狀的貢獻率分散，累積貢獻率增長不明顯，說明性狀變異的多向性。

表 6 各性狀主成分的特征向量及貢獻率Table 6 Eigenvectors and percentages of cumulative contribution of principal components

圖 3 楊桃種質第1、2主成分得分與果實性狀載荷的雙標圖Fig. 3 Biplot of factor scores and loadings based on 1st and 2nd principal components

如表6和圖3所示，第一主成分（PC1）貢獻率為25.18%，特征向量絕對值較大的是SSC、固酸比、總糖含量和甜度值，其特性向量值均在0.60以上，主要反映了果實的含糖量。PC1較高的正值表明楊桃果實甜度值、SSC、固酸比和總糖含量之和高，代表種質有‘馬來西亞紅’、‘臺農1號’、‘廣西3號’和‘臺灣軟枝’；PC1較低的負值表明楊桃果實縱徑和果實橫徑大，代表種質有‘臺農4號’、‘香蜜’和‘馬來西亞B10’。第二主成分（PC2）貢獻率為16.95%，特征向量絕對值較大的是鈣、銅、錳、葡萄糖、果糖、蔗糖、酒石酸、總酸含量和糖酸比，其特性向量值均在0.47以上；PC2較高的正值表明楊桃果實鈣、銅、錳、葡萄糖和果糖含量高，代表種質有‘馬來西亞香蜜’和‘化州紅’；PC2較低的負值表明楊桃果實蔗糖含量和糖酸比高，代表種質有‘臺農2號’、‘廣西1號’、‘大世紀’和‘實生酸’。主成分不同方向的增長結果為楊桃特異種質篩選和優良種質選育提供了理論參考。

圖3比較直觀反映了各種質在前兩個主成分中的分布情況。為綜合評價各種質的果實品質，以主成分貢獻率為權重，計算各種質前6 個主成分的分值與相應權重乘積的之和，得到各種質的綜合得分（表7），各種質綜合得分（Y綜合）＝F1×25.177+F2×16.950+F3×14.501+F4×10.145+F5×8.255+F6×6.605。依據各種質的綜合評價得分，21 份楊桃種質果實品質的綜合排序由高到低分別是：‘臺農1號’、‘馬來西亞紅’、‘化州紅’、‘廣西4號’、‘馬來西亞香蜜’、‘廣西3號’、‘臺灣軟枝’、‘廣西1號’、‘臺農3號’、‘新加坡黃肉’、‘大世紀’、‘新加坡紅肉’、‘實生酸’、‘廣西2號’、‘臺灣秤錘’、‘臺灣金星’、‘臺農4號’、‘馬來西亞B2’、‘臺農2號’、‘香蜜’、‘馬來西亞B10’。

表 7 不同種質主成分值及綜合評價得分Table 7 Values of principal components and synthetic scores of different carambola germplasm accessions

3 討 論

果實品質包括外觀品質和食用品質，大小、形狀、色澤等外觀品質決定著果實賣相，而糖、酸、香味、礦質元素等食用品質決定著果實的營養價值。通過實生變異、種質雜交、生物技術等培育新種質是提升果實品質的重要途徑，而優異親本的選擇是獲得優良后代的物質基礎[14-16]。關于種質資源果實性狀多樣性分析在石榴[17]、梨[18]、葡萄[19]、李[20]等多種果樹中已有報道，而對于楊桃種質資源的研究相對較少。楊桃資源豐富，客觀綜合地認識楊桃種質資源果實外觀和內在品質，對于楊桃種質資源評價與利用、育種目的確定以及通過分子生物學開展果實品質遺傳基礎研究具有重要意義。本實驗從外觀表型品質，以及糖、酸、礦質元素含量內在品質方面分析了21 份楊桃種質資源遺傳多樣性，發現不同種質間果實性狀存在較大差異。因所有種質均生長在同一環境條件下，并采取同一的栽培管理方式，避免了環境和管理措施對果實品質的影響，該數據具有較高的參考價值。變異系數又稱離散系數，反映了某一性狀的變異程度，變異系數越大說明種質間性狀變異的范圍越大[21]。21 份楊桃種質25 項果實品質性狀變異系數為7.44%～109.95%，其中酒石酸含量變異最大、其次為鐵含量、檸檬酸含量和總酸含量，而縱徑和SSC的變異系數最小，是較穩定的指標。在地方梨資源果實性狀多樣性分析時，張起[22]和曾少敏[23]等將變異系數較大的VC含量作為地方梨資源分類的重要指標。本研究中所測21 份楊桃果實酒石酸含量、檸檬酸含量和總酸含量變異系數均在70%以上，因此認為可以利用這3 個指標反映楊桃種質資源間的差異。

通過性狀之間的相關性分析和聚類分析，本研究發現有些楊桃果實品質性狀兩兩之間存在顯著的正相關或負相關關系，如SSC與固酸比，果糖、葡萄糖、蔗糖、總糖含量及甜度值之間；部分性狀之間存在明顯相關性。在種質資源特性評價時，性狀之間的相關性可為觀測性狀的取舍、簡化評測指標體系提供參考依據。但同時也發現多數楊桃果實品質性狀是相互獨立的，它們之間的相關性并未達到顯著水平。PCA是研究多個變量間相關性的一種多元統計方法，通過降維的算法利用較少的變量盡可能多地反映原變量的信息[24-25]。PCA已被廣泛應用于荔枝[26]、芒果[27]、杏[28]、藍莓[29]、蘋果[30]等種質資源遺傳多樣性分析。本研究對21 份楊桃種質的25 項果實性狀進行主成分分析，發現前兩個主成分累積貢獻率僅為42.13%，前7 個主成分的累積貢獻率才達到81.63%，各性狀之間的關系并非緊密，這與性狀之間的相關性分析結果一致，所測各性狀的累積貢獻率增長不明顯，各性狀變異具有多向性。

根據楊桃各種質主成分得分和性狀載荷，本研究發現第一主成分正向增長有利于提高果實含糖量和甜度值，第一主成分負向增長有利于增加果實大小；第二主成分的正向增長有利于提高果實礦質營養含量，第三主成分的正向增長有利于提高果實的有機酸含量。基于PCA，本研究計算了21 份楊桃種質的綜合得分，排名順序體現了各種質果實綜合品質性狀的優劣，其中排名前5位的依次是‘臺農1號’、‘馬來西亞紅’、‘化州紅’、‘廣西4號’和‘馬來西亞香蜜’，這些種質可作為優異候選種質，今后可結合果實發育特性、豐產性、抗逆性等方面的評價，做進一步篩選，最終為栽培推廣及育種提供有價值的種質。