桑葉生物堿對肝纖維化小鼠抗氧化能力及炎癥因子水平的影響

王祖文，沈以紅，黃先智，丁曉雯,*

（1.西南大學食品科學學院，重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶 400716；2.西南大學 家蠶基因組生物學國家重點實驗室，重慶 400716）

肝纖維化是世界范圍內的常見疾病，主要由各種慢性肝損傷引起，包括病毒、酒精、藥物誘導、膽汁淤積和代謝性疾病[1]，其主要特征是肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）沉積[2]。在肝纖維化的發生發展中，氧化應激發揮了重要作用，且與其他因素（如炎癥、細胞凋亡、自噬）相互影響、共同參與[3]。在肝纖維化病理生理過程中，采取一定手段來降低氧化應激及炎癥水平對機體的影響對阻礙肝纖維化發展進程具有重要意義。目前，除了采用藥物防治肝纖維化，許多研究者也把目光轉向一些天然活性物質，如多糖、黃酮、生物堿類化合物。據報道百花花青素[4]、老鼠簕生物堿[5]、金蟬花多糖[6]等活性物質可通過抵抗機體氧化應激、降低炎癥反應，來抑制HSC的激活和ECM沉積，從而逆轉實驗動物肝纖維化。

桑葉生物堿是桑葉的特征活性成分，是糖環上的氧原子被氮原子取代的一系列多羥基生物堿，具有降糖降脂[7-8]、抑制病毒活性[9]、減輕腎損傷[10]、改善小鼠氧化損傷[11]等作用。本實驗室前期研究發現桑葉生物堿可顯著降低肝纖維化小鼠血漿谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，減輕小鼠肝纖維病變程度[12]。鑒于目前鮮見桑葉生物堿在減輕氧化應激以及炎癥反應來改善肝纖維化方面的相關報道，因此本研究從這兩點入手，探討桑葉生物堿對肝纖維化小鼠機體抗氧化能力和炎癥因子的影響，旨在為進一步研究桑葉功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明種小鼠60 只（4 周齡），體質量（20±2）g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（渝）2018-0003；基礎飼料購于重慶醫科大學實驗動物中心；高脂飼料為重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室自制，含基礎飼料69.5%（質量分數，下同）、豬油12%、蔗糖10%、蛋黃粉4%、膽固醇4%、膽酸鈉0.5%。

桑葉粉末由重慶畜牧科學院蠶研所提供；桑葉生物堿（總生物堿質量分數93.57%）為重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室自制[13]。

橄欖油、四氯化碳（CCl4） 成都市科龍化工試劑廠；水飛薊賓（純度98%） 南京道斯夫生物科技有限公司；Masson三色染色試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒 南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-6、環氧化酶（cyclooxygenase，COX）-2酶聯免疫吸附檢測試劑盒上海優選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

EG1105H型石蠟切片機 德國Leica公司；包埋盒江蘇世泰實驗器材有限公司；Synergy H1型酶標儀美國基因有限公司；DHP-9082型恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；生物顯微鏡 日本Olympus株式會社；ALPAAI-4LSC型高速離心機 德國Christ公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司；5880R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理

本研究獲得西南大學實驗動物保護協會許可，小鼠按照西南大學實驗動物保護和使用規則飼養，室溫22～25 ℃，相對濕度40%～60%，12 h明暗交替（9∶00～21∶00），自由進食飲水。60 只昆明種小鼠適應性喂養7 d后，隨機分成正常對照組（10 只）、造模組（50 只）。造模組腹腔注射體積分數10% CCl4橄欖油溶液（5 mL/kgmb），隔天注射1 次，持續8 周，并在此期間給予高脂飼料喂養；正常對照組小鼠腹腔注射等量橄欖油溶液，并給予基礎飼料喂養。造模成功判定：正常對照組和造模組小鼠之間，血漿谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活力、肝纖維4 項指標（透明質酸、層黏連蛋白、III型前膠原、IV型膠原）水平差異顯著（P＜0.05），且肝纖維化小鼠肝臟組織病變明顯，膠原沉積。

將造模成功的50 只小鼠，隨機分成模型組、陽性藥物組和桑葉生物堿低、中、高劑量組，每組10 只。桑葉生物堿低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kgmb的桑葉生物堿溶液，陽性藥物組灌胃100 mg/kgmb水飛薊賓水溶液，正常對照組和模型組給予等量蒸餾水（10 mL/kgmb），每日1 次，連續灌胃45 d，同時喂飼基礎飼料。

1.3.2 實驗樣品收集

末次灌胃后，小鼠禁食不禁水16 h，眼球取血于含有肝素鈉的真空采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，收集上清液，于-80 ℃保存備用。采血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，快速取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗除去表面血液，取肝左葉置于體積分數4%多聚甲醛溶液固定48 h，脫水，石蠟包埋，切片（厚度約為4 μm），進行Masson染色，在光學顯微鏡下（200×）進行肝組織病理學觀察，拍照。

1.3.3 指標測定

稱取0.3 g肝組織，加入9 倍體積的生理鹽水，于冰浴條件勻漿后，于4 ℃、3 000 r/min離心10 min取上清液待測。按照相應的試劑盒說明書標示的步驟測定肝組織TC、TG、HYP（堿水解法）以及血漿MDA、GSH、SOD、T-AOC水平；血漿IL-6、TNF-α及肝組織COX-2水平的測定按照酶聯免疫吸附檢測試劑盒說明書標示的步驟進行。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。實驗結果均以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析比較數據顯著性差異，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠肝組織TC、TG、HYP含量的影響

CCl4產生的CCl3·自由基及一系列的活性氧與生物大分子共價結合將導致合成障礙，造成脂質代謝紊亂，促使TC、TG在肝組織中大量積累[14-15]，在CCl4和高脂飲食兩種因素的聯合作用下會加快肝損傷向肝纖維化的形成[16]。ECM沉積是肝纖維化形成的主要特征之一，表現為膠原蛋白含量顯著增多。HYP是膠原蛋白所特有的氨基酸，其含量可反映細胞合成分泌膠原蛋白的水平，與肝纖維化程度呈正相關，是評估膠原蛋白含量和肝纖維化程度的常用指標[17]。

表 1 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠肝組織TC、TG、HYP含量的影響（n＝10）Table 1 Effect of mulberry leaf alkaloids on the contents of TC, TG and HYP in hepatic tissues of mice with hepatic fibrosis (n= 10)

由表1可知，正常對照組小鼠TC、TG、HYP處于較低水平。與正常對照組比較，模型組小鼠肝組織TC、TG、HYP含量顯著上升（P＜0.05），說明CCl4聯合高脂飲食誘導的小鼠肝臟不僅有大量脂質積累、膠原蛋白增多，還出現了明顯的纖維化。與模型組比，陽性藥物組小鼠TC、TG、HYP含量分別顯著下降53.85%、44.44%、29.60%（P＜0.05）；桑葉生物堿各劑量組小鼠肝組織TC、TG、HYP含量呈現明顯的下降趨勢，其中桑葉生物堿高劑量組TC、TG、HYP分別顯著降低53.85%、41.67%、28.81%（P＜0.05），與陽性藥物組間無顯著差異（P＞0.05），但未恢復至正常水平。以上結果表明，桑葉生物堿能有效降低肝纖維化小鼠TC、TG、HYP水平，減少ECM沉積，減輕肝纖維化程度。

2.2 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿抗氧化相關指標的影響

在肝臟受到氧自由基的攻擊時，機體抗氧化防御系統平衡被打破，導致機體發生氧化應激。MDA是機體發生脂質過氧化反應的主要代謝產物，過量時會嚴重破壞細胞膜結構，也是公認的肝內自由基產生的一個間接指標[18]。內源酶和非酶抗氧化劑共同構成機體的一個復雜的抗氧化防御系統，這些物質共同作用以抵抗自由基對重要生物分子如蛋白質、DNA、脂質乃至機體組織的破壞[19]。GSH是一種重要的細胞無酶抗氧化劑，主要在肝臟中合成，廣泛分布于各種器官內，是自由基的清除劑[20]。SOD是細胞中強大的酶抗氧化劑，與GSH共同作用清除肝內的超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷；SOD水平可間接反映機體清除內氧自由基的能力[21]。僅通過機體GSH、SOD水平來評價機體抗氧化能力是不全面的，因此采用T-AOC共同反映機體的總抗氧化能力[22]。

表 2 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠血漿中抗氧化相關指標的影響（n＝10）Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on antioxidant defense indictors in plasma of mice with hepatic fibrosis (n= 10)

由表2可知，正常對照組小鼠血漿中GSH濃度、SOD活力、T-AOC處于較高水平，MDA濃度處于較低水平。與正常對照組比，模型組小鼠MDA濃度顯著升高了130.67%（P＜0.05）；而GSH濃度、SOD活力、T-AOC分別顯著下降了81.10%、45.14%、57.89%（P＜0.05），說明小鼠肝臟受到自由基攻擊，機體抗氧化系統遭到破壞，清除自由基能力減弱。與模型組比，桑葉生物堿各劑量組的MDA濃度均有所降低，GSH濃度、SOD活力、T-AOC均有所上升；其中，桑葉生物堿高劑量組較模型組小鼠血漿的MDA濃度顯著下降了33.60%（P＜0.05），GSH濃度、SOD活力、T-AOC分別顯著升高了136.83%、45.14%、78.13%（P＜0.05）。高劑量桑葉生物堿對MDA、GSH的作用與該實驗劑量的水飛薊賓效果相當（P＞0.05），對SOD和T-AOC的作用效果不如水飛薊賓，二者差異顯著（P＜0.05）；但無論是該實驗劑量下的桑葉生物堿還是水飛薊賓，均未使上述指標恢復至正常水平。以上結果表明，桑葉生物堿能在一定程度上恢復肝纖維化小鼠的抗氧化能力，減少體內自由基的產生，降低氧化應激水平。

2.3 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠炎癥因子的影響

氧化應激和炎癥緊密聯系，一方面，氧化應激能促進TNF-α、IL-6等炎癥介質的表達；另一方面炎癥細胞活化后產生更多的活性氧，導致炎癥性病變后的氧化應激水平升高[3]。有研究報道稱在肝纖維化動物模型中，血清炎癥因子TNF-α和IL-6水平隨著纖維化程度的加重而升高，呈正相關關系[24]。COX-2參與細胞生長發育、凋亡、惡性轉化、炎癥反應等多種病理過程[24]。有研究認為COX-2是炎癥反應的標志[25]，它介導的炎癥反應在肝纖維化形成過程中起關鍵作用，當機體出現炎癥反應導致肝臟受損，COX-2表達會明顯升高，進而加劇肝損傷[26]。

由表3可知，正常對照組小鼠TNF-α、IL-6質量濃度和COX-2活力處于較低水平。與正常對照組比，模型組小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平分別顯著升高了18.80%、19.92%、28.26%（P＜0.05），說明肝纖維化小鼠機體出現炎癥反應，肝損傷加劇。與模型組比，桑葉生物堿各劑量組小鼠上述指標均有所下降；其中，桑葉生物堿高劑量組小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平分別顯著下降了9.96%、11.06%、10.02%（P＜0.05），與該實驗劑量的水飛薊賓效果相當（P＞0.05），但均未恢復至正常水平。結果表明，桑葉生物堿在一定程度上降低肝纖維化小鼠機體炎癥水平。

表 3 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠TNF-α、IL-6、COX-2水平的影響（n＝10）Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on the contents of TNF-α,IL-6 and COX-2 in mice with hepatic fibrosis (n= 10)

2.4 桑葉生物堿對肝纖維化小鼠肝組織病理學的影響

圖 1 肝纖維化小鼠肝組織病理切片觀察結果（200×）Fig. 1 Histopathological observation of hepatic tissues of mice with hepatic fibrosis (200 ×)

肝組織經Masson染色后，膠原纖維呈藍色，肌纖維呈紅色。由圖1可知，正常對照組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞索排列分布整齊，僅肝小葉內中央靜脈管壁周圍有少量藍色膠原纖維（圖中黑色箭頭所指）。模型組肝小葉結構遭嚴重破壞，可見廣泛致密藍色膠原沉積，肝臟匯管區和中央靜脈周圍纖維組織增生明顯，且纖維組織向肝小葉內延伸形成纖維間隔。與模型組比較，陽性藥物組和各劑量桑葉生物堿組的小鼠肝細胞索排列較為整齊，組織病變及纖維化均有不同程度的改善，以陽性藥物組和桑葉生物堿中、高劑量組改善效果更為明顯，但未恢復至正常水平。組織病理觀察結果與上述指標測定結果一致，說明一定劑量的桑葉生物堿對肝纖維小鼠具有改善作用。

3 討 論

CCl4是使用最廣泛的誘導實驗動物出現肝纖維化的化學性肝臟毒物[27]，在與高脂飲食的聯合作用下，可加快實驗動物肝纖維化的形成[28]。其中，CCl4經微粒體細胞色素氧化酶P450激活產生自由基CCl3·及Cl·，與肝細胞內大分子發生共價結合，引發氧自由基的生成[29-31]。本研究顯示，CCl4聯合高脂飲食作用導致肝纖維小鼠體內氧化應激水平升高，機體抗氧化能力下降，炎癥水平升高。氧化應激在肝損傷中扮演著重要角色，氧化應激的誘導和機體抗氧化系統的失衡是肝纖維發病機制中常見情況[32]。有研究表明，桑葉生物堿能改善D-半乳糖誘導的小鼠機體氧化應激，減輕脂質等生物大分子的氧化損傷[11]。本實驗結果顯示，桑葉生物堿能降低肝纖維化小鼠MDA含量，提高SOD、GSH、T-AOC的水平，猜測桑葉生物堿能通過降低機體的氧化應激水平，提高抗氧化能力，來改善肝纖維化。在肝纖維化期間，炎癥和氧化應激共同促進肝纖維的形成。一些研究報道稱天然活性提取物可通過調節炎癥因子水平來減輕CCl4誘導的肝纖維化小鼠肝組織炎癥壞死和肝纖維病變程度。如馬冬梅等[33]報道田基黃提取物可通過調節IL-6、TNF-α及IL-1β水平來減輕肝纖維化小鼠癥狀；Chiu等[34]的研究也得到類似結果。本實驗結果顯示，在灌胃桑葉生物堿后，肝纖維化小鼠機體IL-6、TNF-α、COX-2炎癥因子水平降低，膠原蛋白含量減少，病理切片同樣觀察到肝組織膠原纖維含量減少，推測桑葉生物堿可通過調節炎癥因子水平從而改善肝纖維化。

綜上所述，桑葉生物堿可改善小鼠肝纖維化程度，其機制可能與抗氧化、抗炎有關。HSC的激活與ECM沉積是肝纖維化典型特征，氧化應激和炎癥能直接激活HSC，而活化的HSC可反過來激活氧化應激和炎癥，促進肝纖維化的發生[3,33]，因此降低小鼠機體氧化應激和炎癥水平對改善肝纖維化有重要意義。本實驗僅是對該方面做了初步探討，具體機制尚不明確，桑葉生物堿能否通過調節氧化應激介導肝纖維化中涉及的相關細胞因子如核轉錄因子κB、轉化生長因子-β/Smads及下游通路來調控HSC表達、改善肝纖維癥狀，還需要進一步深入研究。