注射氨基酮戊酸光動力療法對大鼠痤瘡樣炎性結節模型的療效及組織病理學影響

趙菊花 莊化迪 劉順英 曾潤鑫 宋錦渲

1南充市中心醫院皮膚科 川北醫學院第二臨床醫學院，四川637000；2西南醫科大學研究生院，四川瀘州646000；3川北醫學院臨床醫學院，四川南充637000

中重度痤瘡的皮疹以結節、囊腫為主，屬難治性痤瘡類型，嚴重者可留有凹陷性或者增生性瘢痕。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）治療中重度痤瘡效果良好，目前臨床上常規方法是外敷鹽酸氨基酮戊酸（ALA）溶液后照光，但結節、囊腫等病灶可能因囊腫壁較厚、吸收光敏劑較少致療效欠佳［1］。國外學者［2］將ALA 局部注射到痤瘡患者皮損內進行光動力治療，發現早期改善效果較好，可以減少總治療次數，且不良反應少。目前國內ALA只有外用劑型，直接注射ALA 入痤瘡皮損內的有效性和安全性未見報道。我們配制5%ALA 溶液皮下注射入大鼠耳廓痤瘡樣炎癥結節模型后采用PDT治療，觀察大鼠耳廓的組織病理改變。

一、材料與方法

1.實驗動物：40只SPF級、6 ～8周齡、體重（180±20）g健康SD 大鼠，雌雄各半。由川北醫學院動物中心提供動物、清潔級動物飼養房（溫度25 ℃，濕度50%～60%）和SPF級動物實驗室。實驗動物合格證號為SCXK（川）2018?18，實驗動物使用許可證號為SYXK（川）2018?076。

2.主要試劑及儀器：ALA（上海復旦張江生物醫藥股份有限公司）保存于4 ℃冰箱，實驗當天在避光條件下于118 mg ALA 加入2 ml 滅菌注射用水配成5%ALA 溶液備用。LED?1B 型紅光治療儀［波長（633±10）nm，武漢亞格光電技術股份有限公司］、痤瘡丙酸桿菌標準株（ATCC6919，廣東微生物研究所）。

3.大鼠分組與造模：將大鼠按體重編號，按照隨機數字表將40只大鼠分為正常對照組（10只）、造模組（30只）。將保存于-80 ℃冰箱的痤瘡丙酸桿菌標準株在室溫下復溫，接種于布魯氏瓊脂平板，放入厭氧產氣袋，置于37 ℃CO2培養箱中培養72 h，采用麥氏比濁法計數，用滅菌注射用水調至濃度3×108菌落形成單位/ml，參照文獻［3］和預實驗結果，在造模組每只大鼠右側內耳廓中央皮內注射痤瘡丙酸桿菌液100 μl，隔天同一部位注射1 次，共3 次，最后1 次菌液注射后第7 天肉眼觀察并觸摸到大鼠耳部均有結節，隨機抽取1只大鼠，用無菌針頭挑取鼠耳廓腫脹部位，接種于布魯氏瓊脂培養皿，厭氧罐中培養48 h，證明為痤瘡丙酸桿菌，表明建成大鼠耳痤瘡樣炎性結節模型。造模成功后按照隨機數字表法將造模組分為3 組，即模型對照組、外敷ALA組、注射ALA組，每組10只。

4. 治療方案：正常對照組大鼠正常飼養，不做任何治療。模型對照組造模成功后繼續飼養，不予后續治療。外敷ALA 組采用50 μl 5%ALA 浸濕紗布外敷在皮損處，塑料薄膜封包，避光2 h后照紅光。注射ALA組在耳廓結節處皮下多點注射50 μl 5%ALA溶液，避光2 h后照紅光。照光距離10 cm，能量密度80 mW/cm2，波長633 nm，時間10 min。每周治療1 次，共2 次。末次治療24 h 后麻醉大鼠，取心臟血，并剪取鼠耳組織檢測相關指標。

5.療效觀察：末次治療24 h 后肉眼觀察各組大鼠耳廓紅腫、結節大小、皮損表面情況等。于大鼠右耳耳廓同一部位測量各組大鼠耳廓厚度。

6. 組織病理檢查：剪取鼠耳組織以4%甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察各組組織病理變化。

7.安全性指標檢測：取各組大鼠心臟血，檢測丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、肌酐（Cre）、尿素氮（BUN）。

8. 統計學方法：采用SPSS19.0 統計軟件，計量資料以±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間均數兩兩比較采用LSD?t 檢驗。以P < 0.05 為差異有統計學意義。

二、結果

1.大鼠耳廓厚度比較：實驗結束時，正常對照組、模型對照組、外敷ALA 組、注射ALA 組大鼠耳廓厚度分別為（0.435±0.006）、（1.269±0.071）、（1.088±0.098）、（0.699±0.095）mm，差異有統計學意義（F = 235.60，P < 0.001），模型對照組高于正常對照組、外敷ALA 組和注射ALA 組（t值分別為24.18、5.24、16.48，均P<0.01）；注射ALA 組低于外敷ALA組（t=11.24，P<0.01）。

2.大鼠耳部皮膚大體觀察（圖1）：實驗結束時，正常對照組大鼠右耳廓皮膚無變化；模型對照組自造模完成后，注射局部皮膚持續紅腫，至實驗結束時該紅腫仍持續存在，并在該部位可觸摸到明顯的結節，質較硬；外敷ALA組局部仍有輕度的紅腫，5只大鼠右側耳廓仍可觸摸到結節，但紅腫和結節較模型組軟和小；注射ALA 組3 只大鼠右側耳廓在第1 次注射ALA 的第2 天可見結痂，經外用聚維酮碘處理后，3 ～4 d脫落，實驗結束時7只大鼠右側耳廓紅腫消退，未觸摸到明顯的結節，皮膚表面正常，但3只大鼠右側耳廓皮膚表面于治療處可見輕度瘢痕形成。

3.大鼠耳廓皮膚組織病理（圖2）：實驗結束時，正常對照組大鼠耳廓表皮、真皮、皮脂腺、軟骨、肌肉均未見明顯病變。模型對照組表皮大致正常，真皮深層及皮下組織結構消失，其內可見大量炎癥細胞彌漫性浸潤，8只形成膿腫和炎癥細胞聚集成結節狀，3只耳軟骨結構被局限性破壞，皮脂腺數量較少、體積較小。外敷ALA組表皮大致正常，毛囊皮脂腺縮小，真皮及皮下組織可見炎癥細胞浸潤，5只形成小的微膿腫。注射ALA 組大鼠耳廓表皮正常，真皮及皮下組織內浸潤的炎癥細胞較模型組和外敷ALA 組明顯減少，可見較多的膠原纖維和血管擴張、充血。

4. 大鼠肝腎功能比較：實驗結束時，各組大鼠ALT、AST、Cre、BUN差異均無統計學意義（均P>0.05）。見表1。

三、討論

中重度痤瘡既往多采用維A酸制劑聯合局部外用或系統口服抗生素治療，但因不良反應多，臨床應用受到限制［4］。目前外敷ALA?PDT是治療中重度痤瘡行之有效的方法之一［5］。但以結節、囊腫為主要表現的中重度痤瘡，皮損浸潤較深，還常伴嚴重增厚的囊壁，故常規直接外敷光敏劑ALA 很難被吸收，使PDT 療效不佳［1］。有學者曾用粉刺針清［4］、火針、激光［6］、微針等預處理皮損后形成孔道以增加ALA吸收。有學者［2］將ALA局部注射到痤瘡患者皮損內再行PDT，但大多是一些小樣本的研究，且其療效不一。

本研究參照文獻［7］，以大鼠作為模型動物，經痤瘡丙酸桿菌皮內注射大鼠耳廓內側面造模后，出現了耳廓紅斑、腫脹、結節等表現，且皮損培養證明是痤瘡丙酸桿菌感染。造模后模型組大鼠耳廓紅腫，可觸及結節，且其耳廓厚度明顯大于正常對照組，證明成功制備大鼠耳廓痤瘡樣炎性結節模型。實驗結果顯示，外敷ALA組和注射ALA組與模型對照組比較，大鼠耳廓的腫脹程度和耳廓厚度均顯著降低，提示外敷或注射ALA?PDT 均能抑制痤瘡丙酸桿菌導致的大鼠耳廓腫脹。與外敷ALA組比較，注射ALA組大鼠耳廓厚度減少更明顯，提示注射ALA 到皮損內再照光的光動力治療較直接外敷ALA治療更有效。各組大鼠耳廓外觀和組織病理切片觀察結果顯示，在實驗結束時，模型對照組局部紅腫，仍可觸摸到明顯的結節，質較硬；表皮大致正常，真皮深層及皮下組織結構消失，其內可見大量炎癥細胞彌漫性浸潤，部分形成膿腫，炎癥細胞聚集成結節狀，皮脂腺數量較正常對照組少且體積較小。外敷ALA組局部仍有輕度的紅腫，部分大鼠右側耳廓仍可觸摸到結節，但紅腫較模型組輕，結節較模型組小；表皮大致正常，毛囊皮脂腺縮小，真皮及皮下組織可見較多炎癥細胞浸潤，部分形成小的微膿腫，但炎癥細胞數量較模型對照組少。注射ALA組7只大鼠耳廓紅腫消退，未觸摸到明顯的結節，皮膚表面正常；耳廓表皮正常，真皮及皮下組織內浸潤的炎癥細胞較模型組和外敷ALA 組明顯減少，未見團塊狀分布的炎癥細胞或者微膿腫形成，可見較多的膠原纖維和擴張的血管、充血。上述大體和組織病理學檢查結果提示，注射ALA?PDT 可治療大鼠痤瘡樣炎性結節模型的結節，明顯減輕痤瘡丙酸桿菌引起的炎癥反應，且較外敷ALA?PDT的療效更好。

表1 氨基酮戊酸（ALA）光動力療法對大鼠肝腎功能的影響（±s）

表1 氨基酮戊酸（ALA）光動力療法對大鼠肝腎功能的影響（±s）

注：n=10

組別正常對照組模型對照組外敷ALA組注射ALA組F值P值天冬氨酸轉氨酶（U/L）105.2±17.5 109.5±20.5 102.7±18.1 100.2±18.3 0.45 0.71丙氨酸轉氨酶（U/L）28.8±5.0 31.2±7.6 30.3±7.8 31.1±6.8 0.25 0.85尿素氮（μmol/L）32.0±6.5 34.0±7.8 32.3±7.1 30.3±7.3 0.43 0.73肌酐（μmol/L）5.9±0.6 6.3±0.7 6.2±0.7 6.4±0.9 1.02 0.39

圖1 氨基酮戊酸（ALA）光動力療法治療后各組大鼠耳廓皮膚大體觀 1A：正常對照組皮膚無變化；1B：模型對照組皮膚紅腫，可觸及結節；1C：外敷ALA組可見輕度紅腫，仍可觸及結節；1D：注射ALA治療組紅腫和結節基本消退

圖2 氨基酮戊酸（ALA）光動力療法治療后各組大鼠耳部皮膚組織病理變化（HE×100） 2A：正常對照組表皮真皮結構正常；2B：模型對照組真皮內大量炎癥細胞浸潤，形成團塊狀結節；2C：外敷ALA組真皮內仍有較多炎癥細胞浸潤、微膿腫；2D：注射ALA組真皮內炎癥細胞較少

注射ALA 組3 只大鼠耳廓可見輕度瘢痕形成，而有文獻報道外敷ALA?PDT 可治療兔耳增生性瘢痕模型［8］，故我們認為，注射ALA?PDT 治療后小部分大鼠耳廓注射部位有結痂，可能是注射手法、深淺未控制好，或是因為注射ALA后照光，局部光化學反應過強而在愈合后形成瘢痕，這有待在今后的研究中擴大樣本進行觀察。肝腎功檢測結果顯示，注射ALA組、外敷ALA組與正常對照組比較，各指標均無統計學差異，提示注射ALA?PDT 安全，并未增加不良反應。

綜上所述，本研究顯示，注射ALA?PDT 治療大鼠痤瘡樣炎性結節模型較外敷ALA?PDT 能顯著提高療效，減少炎性結節和炎癥細胞數，且未見肝腎功能損害，提示注射ALA?PDT 治療中重度痤瘡有效且安全，但能否應用于痤瘡患者，以及有無遠期不良反應，還需進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突