缺血后處理對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的保護作用及對鈣敏感受體和Caspase-12表達的影響

張睿，孫繼芾，陳謙，曹蘇成，黃永輝

(1. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013； 2. 江蘇大學附屬醫院脊柱一科，江蘇 鎮江 212001)

脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCIRI) 是指臨床上由于脊柱骨折、胸腹主動脈瘤壓迫等情況下，脊髓在特定時間段進入相對缺血的狀態，醫生通過手術解除壓迫后，脊髓組織得以恢復灌注，但是其功能并沒有恢復，反而在之前的功能障礙上逐漸加重，出現難以逆轉的神經功能損害，甚至導致肢體癱瘓等嚴重后果[1-2]。脊髓神經細胞對缺氧缺血的反應相當敏感，短時間內即可引起明顯的脊髓損傷，目前臨床上仍沒有有效的預防措施[3]。近年來有學者發現，缺血后處理(ischemic post-conditioning,IPC)對SCIRI具有保護效果[4],然而其保護機制尚無定論。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)在機體多個組織器官廣泛表達，參與維持胞內鈣離子穩態[5]。發生SCIRI過程中，神經細胞內鈣超載是關鍵環節，而CaSR在其調節中舉足輕重[6]。研究證實CaSR在大鼠脊髓神經細胞的胞質內廣泛表達，并且在缺血再灌注損傷時表達增加[7]。同時Caspase-12是鈣超載誘導內質網應激導致細胞凋亡這條信號通路中的特異性蛋白[8]，因此Caspase-12表達變化能間接反映CaSR變化。本實驗通過建立大鼠SCIRI模型，觀察IPC對SCIRI的保護作用及IPC后脊髓組織中CaSR和Caspase-12表達的變化。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

清潔級SD大鼠50只，雌性，體重220～250 g，由江蘇大學動物實驗中心提供，合格證號：NO.201905966，許可證號：SCXK(蘇)2018- 0012。β-肌動蛋白抗體、CaSR抗體(兔抗鼠)及Caspase-12抗體(美國CST公司)；羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；GdCl3(美國Sigma公司)；NPS2390(美國Tocris公司)；EnVision免疫組化試劑盒(丹麥Dako公司)；TUNEL檢測試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.2 動物分組

采用SRS抽樣法將50只SD大鼠平均分為5組：假手術組，缺血再灌注模型組(IR組)，IR模型+IPC組(IPC組)，IR模型+IPC+激動劑組(IPC-GdCl3組)和IR模型+抑制劑組(NPS2390組)。

1.3 建立SCIRI模型

IPC-GdCl3組和NPS2390組，提前2天經大鼠尾靜脈分別注射CaSR激動劑GdCl3或CaSR抑制劑NPS2390，劑量分別為30 μmol/kg、10 μmol/kg，注射2天。術前充分禁食禁水。假手術組大鼠予腹腔麻醉(7%水合氯醛)，手術開腹游離腹主動脈，不進行其他處理，暫不完全縫合切口，待30 min左右關腹。其余各組大鼠麻醉后均采用改良Zivin法建立SCIRI模型[9-10]：腹腔注射麻醉，待麻藥起效后(約數分鐘)予腹部備皮，將大鼠牢靠固定于手術臺，予皮膚消毒并鋪巾；取腹正中線切開約3 cm切口，輕輕掀開大網膜及腸管，鈍性分離軟組織，顯露腹主動脈，沿其主干找到腸系膜前動脈及右腎動脈，游離之間的腹主動脈段，使用清潔的金屬動脈夾將其夾閉。為保護大鼠胃腸道等其他內臟器官，先用生理鹽水沖洗局部腹腔，將外翻的大網膜、腸管理順后小心納入切口，切口暫不完全縫合，將動脈夾柄部留于腹腔以外，周圍填蓋清潔溫水打濕的棉球以保暖。25 min后，小心取出動脈夾，恢復血流灌注，予腹腔滴注適量青霉素預防感染，縫合切口，碘伏消毒。IPC組和IPC-GdCl3組在恢復灌注3 min后再次夾上動脈夾3 min，然后松開動脈夾2 min后再次夾閉2 min，最后夾閉1 min后徹底取出動脈夾，縫合。再灌注24 h后(SCIRI后24 h為CaSR受體表達高峰[11])開始BBB(Basso Beattie Bresnahan locomotor rating scale)評分及提取脊髓組織。

1.4 BBB評分

各組大鼠再灌注24 h后分別予BBB評分，判斷大鼠脊髓損傷情況。總共21個分級[12]，無可見后肢運動為0分；持續的掌面移動和協調步態，足趾保持抓地，主動爪始終平行于穩定的軀干，尾巴持續翹起為21分。評分完成后，每組取9只平均分別用于蛋白質印跡、免疫組化以及TUNEL法檢測。

1.5 蛋白質印跡檢測大鼠脊髓組織中CaSR和Caspase-12的表達

處死大鼠，取L2～L4節段脊髓，采用裂解法提取蛋白，并測定蛋白濃度。配置分離膠、濃縮膠，連夾板放入電泳裝置，加電泳液，點樣孔內加蛋白定量標志物4 μL，其余每孔加樣本15～20 μL；電泳電壓70 V，當蛋白泳至分離膠、濃縮膠分界線時，將電壓調至120 V，待蛋白泳至凝膠底部時關閉電源；將凝膠上的蛋白轉至PVDF膜，脫脂牛奶封閉；加一抗(CaSR 1 ∶500；Caspase-12 1 ∶500；β-肌動蛋白1 ∶1 000)，4 ℃慢搖過夜；TBST洗脫，加二抗(1 ∶5 000)，常溫慢搖1 h并洗脫；曝光顯影，測定灰度值并定量分析。

1.6 免疫組織化學檢測大鼠脊髓組織中CaSR和Caspase-12的表達

各組大鼠麻醉，打開腹腔，心尖部插入細管，先用PBS灌洗，然后4%低聚甲醛固定，分離取出L2～L4節段脊髓組織，甲醛浸泡12 h后用PBS充分洗凈；適當修剪組織，予脫水、二甲苯透明，而后制備石蠟切片。使用試劑盒分別進行免疫組化染色。石蠟切片脫蠟，PBS沖洗；3%H2O2孵育10 min；沖洗后稀釋山羊血清封閉10 min；倒去血清滴加一抗CaSR(1 ∶400)和Caspase-12(1 ∶400)室溫孵育2 h；PBS沖洗后，二抗工作液顯色劑復合物孵育30 min，再水洗、復染、脫水、透明、封片。鏡下觀察陽性表達，CaSR陽性呈棕色或褐色，Caspase-12陽性呈藍色。

1.7 TUNEL法檢測大鼠脊髓組織中神經細胞凋亡

大鼠處理及制備石蠟切片同免疫組化，各組操作均按照TUNEL熒光染色試劑盒說明書(羅氏)。熒光顯微鏡下觀察脊髓組織，細胞核呈綠色即為TUNEL染色陽性細胞，各組予陽性細胞計數。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠再灌注后24 h BBB評分比較

假手術組、IR組、IPC組、IPC-GdCl3組和NPS2390組大鼠BBB評分分別為20.80±0.422、9.30±0.949、15.20±0.919、9.00±0.667、14.40±0.843，總體差異有統計學意義(F=384.173，P<0.01)；其中，各建模組BBB評分均明顯高于假手術組(P<0.05)，說明建模后大鼠后肢運動功能明顯損傷，建模有效；IPC組、NPS2390組BBB評分均明顯高于IR組(P<0.05)，說明IPC、抑制劑NPS2390預處理這兩種干預方法均能使大鼠后肢運動功能損傷減輕，IPC與NPS2390均具有相似的保護作用；IPC組BBB評分明顯高于IPC-GdCl3組(P<0.05)，說明經激動劑GdCl3預處理的大鼠IPC治療效果較差。

2.2 各組大鼠脊髓組織中CaSR和Caspase-12蛋白表達比較

蛋白質印跡結果顯示，各模型組CaSR和Caspase-12表達明顯高于假手術組；IPC組較IR組CaSR及Caspase-12表達量明顯降低，且NPS2390組較IR組CaSR及Caspase-12表達量也明顯降低；IPC-GdCl3組較IPC組CaSR和Caspase-12表達量明顯增加。說明IPC抑制了CaSR和Caspase-12的表達。見圖1。

a：P<0.05,與假手術組比較；b：P<0.05,與IR組比較；c：P<0.05,與IPC組比較

2.3 各組大鼠脊髓組織CaSR和Caspase-12免疫組化結果比較

與假手術組相比，各模型組CaSR和Caspase-12表達均明顯增加，說明各組建立SCIRI模型有效。與IR組相比，IPC組、NPS2390組CaSR和Caspase-12表達均明顯降低；與IPC-GdCl3組相比，IPC組CaSR和Caspase-12表達也明顯降低。說明IPC抑制了CaSR和Caspase-12的表達。見圖2、表1。

圖2 免疫組化觀察大鼠脊髓組織CaSR和Caspase-12表達(×400)

2.4 各組大鼠脊髓組織神經細胞凋亡情況

TUNEL染色結果顯示，假手術組可見極少凋亡染色陽性神經細胞。IR組凋亡神經細胞數相比IPC組明顯增加(P<0.05)，較NPS2390組也明顯增加(P<0.05)；IPC組較IPC-GdCl3組凋亡神經細胞數量明顯減少(P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 TUNEL熒光染色觀察各組大鼠脊髓組織細胞凋亡情況(×200)

表1 各組大鼠脊髓組織免疫組化與TUNEL染色定量結果

3 討論

SCIRI的發生和發展是包含多種機制的復雜病理過程，多年來一直沒有成熟的治療措施。缺血后適應最早發現并應用于心肌缺血再灌注損傷過程中，通過在損傷早期及時給予幾個短暫的缺血再灌注循環，從而降低心肌耗氧量、改善心肌代謝，獲得了良好的治療作用[13]。近年來隨著對IPC研究的深入，IPC開始應用于機體多個重要臟器中，相關研究表明在再灌注最早期即采取IPC治療可能獲得更好的效果[14]。受此啟發，本研究在再灌注3 min立即行IPC治療，并且以階梯形式逐漸減少再灌注時間，結果證實這種方法確實顯著提高了BBB評分，改善了大鼠后肢運動功能損傷。

CaSR是一種特殊跨膜受體，是G蛋白耦聯受體超家族C家族成員，可調節細胞內鈣離子的穩態，在細胞的增殖、凋亡等過程中起到關鍵作用[15-16]。有研究報道CaSR 激活增加了氧自由基產生，使組織缺血再灌注損傷加重[17]。為了探究IPC對CaSR的影響，本研究首先需要選擇CaSR的特異性激動劑和抑制劑。多數研究者認為只需要在實驗前2日連續大鼠尾靜脈注射氯化釓(GdCl3)試劑，即可有效激活CaSR，增加其表達量[18]，劑量以大鼠體重為指標30 μmol/kg為宜[19]；在抑制劑方面，有報道稱小劑量精胺可以抑制CaSR，不過其抑制作用與代謝有關系，難以精準把控，而NPS2390的組織富集作用較為穩定[20-21]，以10 μmol/kg提前2日注射可減少CaSR表達，所以本研究將CaSR的抑制劑確定為NPS2390。TUNEL染色結果顯示，建模各組細胞凋亡數均明顯多于假手術組，說明SCIRI是一種短時間內難以逆轉的損傷；IPC組及NPS2390組神經細胞凋亡數均明顯低于IR組，說明IPC對大鼠SCIRI起到一定程度的保護作用，且與抑制劑保護作用相似。

本課題組前期的實驗已經證實在大鼠SCIRI過程中，CaSR表達增加導致鈣超載從而加速細胞凋亡，并且CaSR激動劑會加重大鼠SCIRI，CaSR抑制劑則一定程度緩解大鼠SCIRI[7,11]。本實驗蛋白質印跡及免疫組化結果顯示，建模各組CaSR表達均高于假手術組，說明大鼠SCIRI模型建立成功；IPC組及NPS2390組較IR組CaSR表達均明顯減少，且IPC-GdCl3組CaSR表達量明顯高于IPC組，反映出IPC與CaSR抑制劑作用性質相同，與CaSR激動劑則有拮抗作用，即IPC抑制了CaSR表達。

Caspase-12位于內質網外膜，是內質網應激介導的凋亡的關鍵蛋白酶[22]。內質網應激通過Caspase-12獨立誘導細胞凋亡。當內質網受到損傷時，無活性的Caspase-12酶原被激活，具有活性的Caspase-12可以激活Caspase-9、Caspase-3等酶原，通過Caspase級聯反應促使細胞凋亡，因此Caspase-12在啟動內質網凋亡途徑中具有核心作用[23]。本研究結果顯示，IPC組Caspase-12表達明顯低于IR組，可以看出IPC能夠抑制Caspase-12表達；其余各組比較結果幾乎與CaSR表達的組間比較一致。這是由于在大鼠脊髓缺血再灌注過程中，CaSR過表達引起神經細胞內鈣超載，破壞了鈣的穩態，從而誘發過度內質網應激，Caspase-12活化片段表達增多，經一系列復雜的信號轉導最終發生神經細胞凋亡，因此IPC抑制了CaSR表達，繼而同步抑制了Caspase-12的表達。另外，本研究發現IPC與CaSR抑制劑NPS2390具有類似的保護作用，但是臨床上CaSR抑制劑幾乎無應用，可能是由于CaSR存在于機體較多組織器官，盲目用藥會引起難以預知的毒副作用。但IPC治療效果是否優于抑制劑或者兩者之間是否有預防及治療上的協同作用，有待深入研究。

近年來關于大鼠腦組織缺血再灌注損傷的研究證實，遠隔缺血后處理能夠抑制神經細胞的CaSR表達[24]，但是IPC調控CaSR表達的機制尚不明朗。我們推測其可能機制為：在脊髓發生缺血再灌注后第一時間進行IPC操作，使細胞很快適應灌注狀態，部分已經激活的CaSR重新失去活性，這就解釋了IPC使CaSR蛋白表達下調的原因。關于CaSR與Caspase-12的表達調控關系，目前認為CaSR的表達下調使Ca2+內流也相應減少，細胞內鈣穩態相對平衡，誘發的內質網應激較少或者應激持續時間較短，繼而Caspase-12活化減少，所以Caspase-12蛋白相應下調。

綜上所述，IPC對大鼠SCIRI具有保護作用，且抑制脊髓組織中CaSR及Caspase-12的表達，其保護機制或可能與內質網應激減少有關。但IPC減輕脊髓缺氧復氧損傷的機制和信號轉導途徑錯綜復雜，仍需進一步探究。