人多能干細胞在環境污染物風險評估中的應用與展望

楊仁君，任悅，沈素，殷諾雅，Francesco Faiola，張楊,*

1. 中國科學院生態環境研究中心，環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學資源與環境學院，北京 100049 3. 首都醫科大學附屬北京友誼醫院藥學部，北京 100050

隨著世界經濟的發展、科技的進步和人類物質需求的日益增長，許多新型化學品被合成、制造和應用。新型化學品在為人們的工作和生活提供便利的同時，也帶來了日益嚴峻的安全問題。近年來，由未經毒理學評估的化學品引起的健康危害事件頻繁發生，為解決這一問題，人們亟需開發出一套高通量且高靈敏的毒理學評價體系，在新型化合物應用之前及時進行風險評估。

毒理學的研究長期以來非常依賴動物模型。動物實驗存在著通量低、成本高的缺點，而且由于物種間的差異，基于動物實驗得到的結果并不都適用于人類。體外細胞實驗的興起，提供了解決上述問題的途徑。首先，體外細胞培養條件簡單可控，解決了毒理學實驗使用動物模型難以高通量化的問題。其次，細胞培養成本較低，解決了動物模型成本高昂的問題。再次，體外細胞實驗不僅可以進行實時監測，還具有多種多樣的生物學檢測終點，使得化合物的致毒機制研究更為靈活多樣。此外，使用人體細胞為模型得到的實驗結果，還能夠更準確地反映環境污染物對人體健康的影響。綜上所述，體外細胞實驗可以彌補動物實驗的不足，實現環境污染物毒性的高效篩查，有力地推進環境污染物致毒機制研究，有望在將來建立起一套完整的結構-毒性效應體系，并且用于指導安全化合物的合成。干細胞毒理學是目前體外毒理學的一個新興分支，本文將重點介紹多能干細胞毒理學的研究成果，闡述它為傳統毒理學評估提供的補充和幫助，以期對干細胞在環境污染物風險評估中的應用提供參考、拓寬思路。

1 干細胞毒理學發展簡介(Brief introduction to the development of stem cell toxicology)

多能干細胞(pluripotent stem cells, PSCs)是一類擁有自我更新能力、近乎無限的增殖能力和可分化為成體幾乎所有類型細胞潛能的細胞。從囊胚期內細胞團中分離得到的胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)和通過重編程得到的誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)均屬于PSCs[1]。1981年，Evans和Kaufman[2]成功分離了小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)并建立了培養體系。1997年，研究者提出了胚胎干細胞測試準則(Embryonic Stem Cell Test, EST)，建立了首個基于胚胎干細胞的發育毒性評估模型[3-4]。1998年，Thomson等[5]成功分離了人胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)，并建立了體外培養體系。1999年，歐洲替代方法研究中心ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods)的研究證明，使用EST模型可以準確地評估環境污染物的胚胎發育毒性[6]。2007年，Takahashi等[7]成功將人成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞，2008年，Park等[8]利用重編程技術，成功建立疾病特異性的iPSCs細胞系，解決了特定人群的特定組織樣品難以獲取和擴增的問題，為精準醫療和人群特異性毒性評價的發展奠定了基礎。2008年，首個與小鼠EST相對應的人胚胎干細胞測試準則建立[9]，在接下來的10年時間里，hESCs逐步成為毒理學和藥理學研究的熱點，而其中最激動人心的三類突破是：(1)利用胚胎干細胞近乎無限的增殖能力和分化成成體各種細胞類型的能力，大量生產特定類型的細胞，解決了心肌細胞等原代細胞無法大量增殖的問題，進而實現了體外毒性評估的高通量化[10]；(2)利用體外胚胎干細胞分化過程模擬體內人胚胎的發育過程，基于不同分化模型構建了不同毒理學檢測體系，可以用來評估化合物對人胚胎發育各個過程的毒性作用，預防藥物或環境污染導致的胎兒畸變事件發生；(3)使用胚胎干細胞分化而來的類器官模擬真實生理狀態下的組織器官進行化合物毒性檢測，能更加準確地反映化合物在人體中的作用，再結合新興的單細胞測序等分析技術，可以從類器官和單細胞2個層面高效立體地解析化合物的效應和機制(圖1)。

在環境污染物毒性研究的過程中，多能干細胞體外實驗模型的應用，有利于準確、靈敏地評估環境污染物對不同細胞、組織、器官或發育過程的毒性效應。干細胞體外實驗模型結合高通量分析方法，還可以獲得大量多層次的相關聯毒性數據，極大地推進致毒機制的解析以及化合物結構-毒性效應關系的建立。雖然，目前干細胞在環境污染物毒性評估方面的應用仍處于探索階段，但其發展潛力已展露無遺[4-5,11]。

圖1 干細胞毒理學發展簡介Fig. 1 Development of stem cell toxicology

2 人多能干細胞在基礎毒性評估中的應用(The application of hESCs in basic toxicity evaluation)

在現代毒理學研究中，體外細胞實驗具有系統簡單、條件可控、實驗周期短以及易于高通量化等特點。相比于癌細胞，胚胎干細胞具有正常的核型，在基礎毒性測試中能夠更加客觀地反映化合物與正常細胞之間的作用；相比于原代細胞，胚胎干細胞的增殖能力更強，通過誘導分化可以大量獲得不同原代細胞的替代品，為實現實驗的高通量化創造條件。胚胎干細胞在基礎毒性檢測中的應用可以追溯到1991年，Laschinski等[3]從囊胚中分離出整倍體mESCs，隨后使用MTT法同時檢測了多種化合物對mESCs和成纖維細胞的細胞毒性，相關測試結果不僅與之前活體動物實驗結果高度吻合，還顯示mESCs比已分化細胞具有更高的敏感性。隨著hPSCs培養體系的建立以及誘導分化技術的不斷突破，hPSCs以及其分化而來的細胞也被應用于基礎毒性檢測當中，并且毒性檢測方法也逐漸走向高通量化。2016年，Pei等[12]建立了一套基于hiPSCs和hiPSCs分化而來的細胞(神經干細胞、神經元和星形膠質細胞)的高通量化合物毒性篩查系統，隨后使用該系統研究了包括神經毒素、發育神經毒素和環境污染物在內的80種化合物在10mol·L-1和100 μmol·L-1時的毒性。MTT細胞毒性檢測實驗結果表明，在被測試的80種化合物中，有50種化合物對上述4種細胞中的至少一種具有細胞毒性，其中纈霉素、四溴雙酚A、溴氰菊酯和磷酸三苯酯對4種細胞均具有顯著的細胞毒性。可見，使用胚胎干細胞分化系統，便于建立基于各種不同類型細胞的高通量化毒性篩查平臺，可以極大地推進化合物毒性敏感階段和靶點細胞的確定。同時，環境污染物四溴雙酚A、溴氰菊酯和磷酸三苯酯相比于其他已知神經毒劑具有更廣泛的毒性效應，說明了使用基于hPSCs和不同分化細胞的高通量毒性篩查平臺進行環境污染物基礎毒性篩查的必要性。

3 人多能干細胞在發育毒性評估中的應用(The application of hESCs in developmental toxicity evaluation)

干細胞毒理學研究除了關注化合物對細胞活力、胞內活性氧自由基水平和胞膜完整性等基礎毒性指標之外，更關注化合物在非致死濃度下對干細胞自我更新能力、分化潛能以及分化過程的影響。而且，hPSCs分化模型也是目前直接研究化合物對人早期胚胎發育作用的唯一有效模型。1997年，Spielmann等[4]在基于mESCs的胚胎發育毒性檢測方法中引入了擬胚體(embryoid bodies, EBs)分化實驗，在EBs分化過程中給藥處理，隨后根據分化末期跳動EBs的數量來評估化合物對分化實驗效率的影響，該實驗方法即為胚胎干細胞在發育毒性評估中的應用雛形。hPSCs分化模型的建立為發育毒性研究提供了多種可選方向，使人們能夠全面地解析某個或某類化合物對胚胎干細胞不同分化過程的影響，有利于揭示化合物胚胎發育毒性的靶向性及致毒機制。

3.1 人多能干細胞在環境污染物神經發育毒性評估中的應用(The application of hESCs in developmental neural toxicity evaluation)

目前，基于hPSCs的神經、肝臟、心臟、胰腺和皮膚發育毒性的研究均有報道，其中，神經系統最容易受到外界因素干擾，因而成了胚胎干細胞發育毒性研究的熱點[13-14]。神經系統是動物和人類進行思考、行為和生理活動的調控樞紐，發育過程極其復雜，需要有程序地進行神經元的發生、神經元的遷移、突起長出和突觸連接形成等過程，耗時長達數年。已報道的相關神經發育毒性研究涉及神經叢形成[15]、神經前體發育[16]和多巴胺能神經元發育等各個過程[17-18]。

2019年，Chen等[19]使用hPSCs神經分化系統，研究了溴代阻燃劑多溴聯苯醚(PBDEs)同系物BDE-47和BDE-99對人早期神經發育不同階段的影響。該研究將hPSCs神經分化過程分為hESC自我更新、EB三胚層形成、EB外胚層至神經叢形成、神經前體增殖和神經球擴張等5個階段。分段式的研究結果顯示，神經前體階段的細胞對PBDEs引起的細胞毒性較為敏感，并且在亞致死濃度下，BDE-47即可抑制神經前體細胞(NPCs)的增殖和神經元的生成。隨后，轉錄組和甲基化組學分析顯示，PBDEs暴露影響細胞氧化應激、細胞周期、激素信號、類固醇代謝和神經發育等生理過程，并且導致CpG甲基化顯著增加。該研究表明，運用hPSCs神經分化系統分段式的研究，有利于找出化合物作用的敏感時期，并且大量的組學數據也為全面揭示PBDEs的毒性效應奠定了基礎。

目前，基于hPSCs的神經發育毒性研究，因為分化方法的不同而種類繁多。然而，大多數實驗都只是獨立地研究特定化合物對特定神經分化過程的影響，如何形成一套完整的發育神經毒性評價體系以及如何整合已有研究成果，從而形成各種化合物的結構-神經毒性效應體系，是該研究方向面臨的一大挑戰。

3.2 人多能干細胞在環境污染物肝臟發育毒性評估中的應用(The application of hESCs in developmental hepatic toxicity evaluation)

肝臟是人體至為重要的解毒器官，在解毒的同時，往往會因為化合物的累積，給自身帶來損傷。以往的大多數研究只關注化合物對肝臟或肝細胞的影響，而很少關注胚胎發育時期化合物暴露對肝臟發育的影響。然而，近年來基于小鼠模型的研究顯示，胚胎發育時期內分泌干擾物的暴露會增加后天患非酒精性脂肪肝病的風險，表明胚胎發育時期化合物暴露造成的影響同樣不可小覷[20]。

目前，Liang等[21]已建立一套基于hPSCs肝臟分化模型的毒性檢測系統。使用甲狀腺素T3和T4作為陽性化合物對該系統進行驗證，結果表明，該系統可以很好地反映過量甲狀腺素處理對肝臟細胞分化造成的影響，具體表現為分化末期細胞內脂肪的大量積累和糖原貯存能力偏低。同樣，在上述研究中，研究者還研究了與甲狀腺素結構類似的環境污染物BDE-47和BDE-209對肝臟分化的影響。實驗結果表明，PBDEs和甲狀腺激素處理均能夠促進CYP家族(CYP1A1、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4和CYP3A7)肝臟標志基因的表達，但對PPARA和HNF4A等基因的作用相反，可見PBDEs和甲狀腺激素對肝臟發育的影響有類似之處，但又不完全相同，暗示PBDEs還影響肝臟分化過程中的其他關鍵靶點[21]。該研究為揭示PBDEs的人體肝臟發育毒性提供了線索。上述研究系統是目前已報道的首個基于hPSCs的肝臟發育毒性評估系統，但該系統的應用目前仍不成熟，將來更多檢測終點的加入有望使該系統不斷完善，最終成為一套全面的肝臟發育毒性評估系統。

3.3 人多能干細胞在環境污染物心臟發育毒性評估中的應用(The application of hESCs in developmental cardiac toxicity evaluation)

心臟是人體的泵血器官，先天性心臟畸形是較為普遍的先天性畸形病癥，全世界每年有約1%的新生兒患有該病[22-23]，然而先天性心臟病的病因往往難以明確。目前，已知孕期藥物和環境污染物的暴露會增加新生兒罹患先天性心臟病的風險，因此，近年已有研究建立了基于hPSCs的心臟發育毒性檢測系統，并以二惡英類化合物2,3,7,8-TCDD為例，研究了環境污染物的心臟發育毒性[24]。該研究同樣采取了分段式的研究方法，研究了在胚胎干細胞、中胚層、心臟中胚層、心肌前體或心肌細胞階段TCDD處理對心臟分化的影響。結果顯示，在胚胎干細胞階段或中胚層階段TCDD的暴露會顯著抑制心臟分化。后續轉錄組分析和染色質免疫沉淀測序分析(ChIP-seq)結果表明，TCDD在hPSCs分化早期會作用于芳香烴受體(AhR)，促使其與基因組DNA的反式作用元件結合，抑制中胚層相關基因的表達，進而抑制心臟分化。該研究結論與利用動物模型和小鼠細胞模型得到的研究結果一致[24]，證明了使用該系統研究化合物對人胚胎心臟發育過程的影響是可行的。

3.4 人多能干細胞在環境污染物胰腺發育毒性評估中的應用(The application of hESCs in developmental pancreatic toxicity evaluation)

胰腺是人體內具有外分泌和內分泌功能的重要器官，與消化和糖代謝密切相關。胰腺發育相關研究在哺乳動物中難以進行，因此，往往需要依賴斑馬魚等脊椎動物模型[25]。hPSCs胰腺分化方法的突破為人胰腺發育毒性的研究提供了一個新思路。目前，Liu等[26]已初步建立了基于hPSCs胰腺分化的胰腺發育毒性研究系統，并研究了持久性有機污染物全氟辛基羧酸(PFOA)和全氟辛基磺酸(PFOS)的胰腺發育毒性。結果表明，低至5 nmol·L-1的PFOA和PFOS處理就會抑制胰腺分化，具體表現在抑制了胰腺分化過程中內胚層標志基因(FOXA1、FOXA2、SOX7和SOX17)和胰腺相關重要轉錄因子(HNF1b、HNF4a、HNF6、PDX1和SOX9)的表達。該結果與已有動物實驗結果和流行病學調查結果相吻合[27-31]，暗示PFOA和PFOS干擾人胚胎發育早期階段胰腺發育[26]。上述研究表明，基于胚胎干細胞的胰腺分化模型可以方便、快捷并靈敏地反映極低劑量環境污染物誘發的胰腺發育毒性[26]，該胰腺發育毒性模型的發展和完善將極大地推進化合物胰腺發育毒性的研究。

3.5 人多能干細胞在環境污染物皮膚發育毒性評估中的應用(The application of hESCs in developmental skin toxicity evaluation)

表皮是皮膚對外的屏障，可以起到阻止外界病原入侵、抵御輻射和防止機體水分丟失等作用[32]。表皮中90%的細胞是角質形成細胞，正常狀態下，角質形成細胞可以自我更新、增殖并修復受損的表皮，而病理狀態下角質形成細胞是表皮性水皰、牛皮癬等皮膚炎癥作用的靶點[33]。目前，有關化合物的皮膚發育毒性的相關研究非常匱乏，Cheng等[34]建立了基于hPSCs分化的皮膚發育毒性檢測模型，并研究了空氣污染物超細碳顆粒物對皮膚發育的影響。結果表明，超細碳顆粒物暴露使角質形成細胞前體相關基因KRT8、KRT18和ΔNP63表達水平上升，成熟相關基因KRT14、KRT5、KRT16和COL7A1表達水平下降，同時，使牛皮癬相關基因S100A7、S100A9和炎癥相關因子表達水平顯著上升。上述結果顯示，超細碳顆粒物可以影響表皮發育過程，增加表皮炎癥疾病的發病率[34]。該研究顯示了空氣污染對嬰幼兒皮膚發育的潛在影響，為揭示超細碳顆粒的毒性效應提供了幫助。同時，該研究也是人體皮膚發育毒性研究的初探，在將來，表觀遺傳組等各種組學技術與皮膚發育毒性研究的結合或許能夠揭示環境污染與人體皮膚敏感性的關聯。

目前，在生命科學領域，與干細胞相關的誘導分化方法層出不窮，基于誘導分化而形成的細胞的自動化、高通量毒性研究方法也逐漸增多。然而，如何利用多能干細胞的優勢來評估環境污染物對人胚胎早期發育過程的影響依舊是一個亟待探索的領域。由于人體發育過程本身的復雜性，每個發育階段都存在著多種細胞類型和復雜的生命活動，如何通過眾多的誘導分化手段在體外模擬人胚胎分化到某個特定階段的過程，又如何將同種化合物在獨立研究中取得的毒性數據進行整合分析，最終準確預測化合物的靶點和致毒機制，是該領域面臨的一大挑戰。

4 人多能干細胞在器官毒性評估中的應用(The application of hESCs in organ toxicity evaluation)

隨著胚胎干細胞不同誘導分化方法的發展，研究人員開始嘗試使用分化而來的細胞構建高仿真3D組織。在過去幾年里，出現了2種不同的技術來模擬體內器官的真實情況：(1)依賴干細胞生物學的自組織類器官技術；(2)依賴生物工程手段的器官芯片技術。3D類器官是與對應的器官具有類似的空間組織和功能的三維細胞培養物。類器官技術首先通過不同的方法誘導胚胎干細胞定向分化，獲得處于特定發育階段的干細胞或祖細胞，隨后將這些細胞按照某種特定方式混合，使其自組裝并且發育形成類器官。一般通過單層分化得到的細胞都處于未成熟的狀態，然而，一系列研究表明，使用分化到某一特定階段的細胞自組裝構建出的類器官內的細胞往往更為成熟，因此，3D類器官的基因表達、細胞外基質分泌以及細胞功能活動更為接近體內器官[35-37]，并且更適合進行化合物的器官毒性研究。目前，可以構建的類器官包括大腦[38]、心臟[39]、肝臟[40-41]、胰腺[42]、肺[43]、腎[44]、輸卵管[45]、視網膜[46]、角膜[47]、唾液腺[48]、子宮內膜[49]和血管[50]等。部分人源類器官已經被應用于再生醫學或化合物毒性評估當中。

在腦類器官方面，Schwartz等[51]將hPSCs分化而來的神經前體細胞、內皮細胞、間充質干細胞和小膠質/巨噬細胞前體細胞共同培養，使這些前體細胞自組裝成具有三維神經結構和血管網絡的腦類器官。隨后使用上述腦類器官檢測了包括環境污染物二惡英在內的34種神經毒劑和26種無毒化合物對基因表達譜的影響，并且應用機器學習的方法，根據有毒和無毒情況下腦類器官基因表達譜的變化，建立了基于計算機識別毒性特異基因表達譜的化合物神經毒性評估模型。該研究不僅提供了一個可行的腦類器官構建方法，還證明了通過計算機識別毒性特異基因表達譜的方法評估化合物毒性的可行性。相較于細胞活力，化合物在低濃度下往往首先影響基因的轉錄，因此，基于轉錄組分析的毒性篩查方法更加靈敏。隨著機器學習技術的進步和轉錄組測序成本的下降，計算機識別毒性特異基因表達譜的方法或能得以推廣，從而建立起一些高靈敏、高通量的毒性篩查系統。在心臟類器官方面，Mills等[52]已經建立了高通量心臟類器官毒性評估系統，使用該系統研究了105種潛在的促再生小分子，并且成功地從中篩選出2種不會影響心臟功能的促再生分子，初步揭示了其促再生機理。在肝臟類器官方面，李朋彥等[53]使用3D肝臟類器官模型，研究了該模型對陽性對照物胺碘酮、環孢霉素和陰性對照藥物阿司匹林的不同反應，初步證實了該系統在檢測肝臟毒性時的準確性。在腎臟毒性方面，Czerniecki等[54]更是建立了一套全自動化、高通量的腎臟類器官形成及腎毒性評估系統，使用該系統有望高效地進行化合物腎毒性的研究。

雖然基于現有技術構建的3D類器官還不能完美地模擬體內成熟器官，但使用類器官代替人體臟器系統進行研究是毒理學研究發展的趨勢之一。在不遠的將來，類器官構建技術的突破以及基于類器官的毒理學研究系統的高通量化，有望帶來人體器官毒性研究的飛躍。此外，目前人源類器官的應用大多集中在藥物的開發上，而實際上環境污染物對人體健康的效應同樣值得關注，因此，人源類器官模型在環境污染物器官毒性評估方面的應用亟待開發。

器官芯片是通過微流控等生物工程學方法精確模擬體內環境培養細胞的技術[55-56]。該領域最早的研究報道于2010年，Huh等[57]使用經典的軟光刻技術和微流控技術創建了一個肺芯片，用來模擬人類肺泡毛細血管界面，使人們能夠模擬肺部炎癥和感染。近年來，器官芯片領域飛速發展，大量研究報道了各種器官芯片的構建。胚胎干細胞相關技術的成熟為使用器官芯片進行疾病特異性藥物的開發或人群特異性污染物毒性的評估提供了便利。同時，類器官技術與器官芯片技術的結合，也將使化合物的器官發育毒性的研究更上一層樓[58]。在研究環境污染物的毒性效應方面，器官芯片和類器官芯片有著極大的應用空間。

5 總結與展望(Summary and prospects)

近年來，干細胞生物學的發展為環境污染物毒性的體外研究提供了許多有利條件和新的途徑。通過擴增胚胎干細胞并且誘導其分化，可以大量獲得特定類型的細胞，從而解決某些原代細胞難以大量增殖的問題，為環境污染物毒性評估的高通量化奠定了基礎。使用胚胎干細胞分化來模擬人體胚胎發育的過程，可以在體外研究環境污染物的人體胚胎發育毒性，從而獲得相比于動物實驗更加接近人體發育過程的毒性數據。使用胚胎干細胞分化而來的細胞構建類器官，可以建立起更加接近人體內真實情況的器官毒性評價體系，實現人體器官毒性的體外評估。同時，多種毒性評估方法的應用，又將有助于全方位地評估環境污染物對人體各種細胞、組織、器官和發育過程的影響，進而全面揭示其致毒機制。目前，多數基于干細胞模型的環境污染物毒性研究都是獨立進行的，使用的模型和研究對象也各不相同，如何將相關研究結果進行整合分析，并總結出某類化合物的毒性靶點和毒性規律是現階段需要解決的一大難題。未來，把基于干細胞的各種細胞毒性、發育毒性和器官毒性研究方法進行整合，建立一套完整的干細胞毒理學評價體系并實現高通量化，將是一項極其龐大而又意義深遠的工程。毋庸置疑，干細胞毒理學的發展能夠有力地推進環境污染物的毒性評估。基于現有的研究結果，人們有望在將來建立一套化合物結構-毒性效應關系體系，用以指導安全化合物的合成。