人多能干細(xì)胞在環(huán)境污染物風(fēng)險(xiǎn)評估中的應(yīng)用與展望

楊仁君，任悅，沈素，殷諾雅，F(xiàn)rancesco Faiola，張楊,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085 2. 中國科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049 3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100050

隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、科技的進(jìn)步和人類物質(zhì)需求的日益增長，許多新型化學(xué)品被合成、制造和應(yīng)用。新型化學(xué)品在為人們的工作和生活提供便利的同時(shí)，也帶來了日益嚴(yán)峻的安全問題。近年來，由未經(jīng)毒理學(xué)評估的化學(xué)品引起的健康危害事件頻繁發(fā)生，為解決這一問題，人們亟需開發(fā)出一套高通量且高靈敏的毒理學(xué)評價(jià)體系，在新型化合物應(yīng)用之前及時(shí)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。

毒理學(xué)的研究長期以來非常依賴動(dòng)物模型。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在著通量低、成本高的缺點(diǎn)，而且由于物種間的差異，基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果并不都適用于人類。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的興起，提供了解決上述問題的途徑。首先，體外細(xì)胞培養(yǎng)條件簡單可控，解決了毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)使用動(dòng)物模型難以高通量化的問題。其次，細(xì)胞培養(yǎng)成本較低，解決了動(dòng)物模型成本高昂的問題。再次，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不僅可以進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，還具有多種多樣的生物學(xué)檢測終點(diǎn)，使得化合物的致毒機(jī)制研究更為靈活多樣。此外，使用人體細(xì)胞為模型得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還能夠更準(zhǔn)確地反映環(huán)境污染物對人體健康的影響。綜上所述，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)可以彌補(bǔ)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的不足，實(shí)現(xiàn)環(huán)境污染物毒性的高效篩查，有力地推進(jìn)環(huán)境污染物致毒機(jī)制研究，有望在將來建立起一套完整的結(jié)構(gòu)-毒性效應(yīng)體系，并且用于指導(dǎo)安全化合物的合成。干細(xì)胞毒理學(xué)是目前體外毒理學(xué)的一個(gè)新興分支，本文將重點(diǎn)介紹多能干細(xì)胞毒理學(xué)的研究成果，闡述它為傳統(tǒng)毒理學(xué)評估提供的補(bǔ)充和幫助，以期對干細(xì)胞在環(huán)境污染物風(fēng)險(xiǎn)評估中的應(yīng)用提供參考、拓寬思路。

1 干細(xì)胞毒理學(xué)發(fā)展簡介(Brief introduction to the development of stem cell toxicology)

多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells, PSCs)是一類擁有自我更新能力、近乎無限的增殖能力和可分化為成體幾乎所有類型細(xì)胞潛能的細(xì)胞。從囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離得到的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)和通過重編程得到的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)均屬于PSCs[1]。1981年，Evans和Kaufman[2]成功分離了小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)并建立了培養(yǎng)體系。1997年，研究者提出了胚胎干細(xì)胞測試準(zhǔn)則(Embryonic Stem Cell Test, EST)，建立了首個(gè)基于胚胎干細(xì)胞的發(fā)育毒性評估模型[3-4]。1998年，Thomson等[5]成功分離了人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)，并建立了體外培養(yǎng)體系。1999年，歐洲替代方法研究中心ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods)的研究證明，使用EST模型可以準(zhǔn)確地評估環(huán)境污染物的胚胎發(fā)育毒性[6]。2007年，Takahashi等[7]成功將人成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，2008年，Park等[8]利用重編程技術(shù)，成功建立疾病特異性的iPSCs細(xì)胞系，解決了特定人群的特定組織樣品難以獲取和擴(kuò)增的問題，為精準(zhǔn)醫(yī)療和人群特異性毒性評價(jià)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。2008年，首個(gè)與小鼠EST相對應(yīng)的人胚胎干細(xì)胞測試準(zhǔn)則建立[9]，在接下來的10年時(shí)間里，hESCs逐步成為毒理學(xué)和藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)，而其中最激動(dòng)人心的三類突破是：(1)利用胚胎干細(xì)胞近乎無限的增殖能力和分化成成體各種細(xì)胞類型的能力，大量生產(chǎn)特定類型的細(xì)胞，解決了心肌細(xì)胞等原代細(xì)胞無法大量增殖的問題，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了體外毒性評估的高通量化[10]；(2)利用體外胚胎干細(xì)胞分化過程模擬體內(nèi)人胚胎的發(fā)育過程，基于不同分化模型構(gòu)建了不同毒理學(xué)檢測體系，可以用來評估化合物對人胚胎發(fā)育各個(gè)過程的毒性作用，預(yù)防藥物或環(huán)境污染導(dǎo)致的胎兒畸變事件發(fā)生；(3)使用胚胎干細(xì)胞分化而來的類器官模擬真實(shí)生理狀態(tài)下的組織器官進(jìn)行化合物毒性檢測，能更加準(zhǔn)確地反映化合物在人體中的作用，再結(jié)合新興的單細(xì)胞測序等分析技術(shù)，可以從類器官和單細(xì)胞2個(gè)層面高效立體地解析化合物的效應(yīng)和機(jī)制(圖1)。

在環(huán)境污染物毒性研究的過程中，多能干細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膽?yīng)用，有利于準(zhǔn)確、靈敏地評估環(huán)境污染物對不同細(xì)胞、組織、器官或發(fā)育過程的毒性效應(yīng)。干細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)合高通量分析方法，還可以獲得大量多層次的相關(guān)聯(lián)毒性數(shù)據(jù)，極大地推進(jìn)致毒機(jī)制的解析以及化合物結(jié)構(gòu)-毒性效應(yīng)關(guān)系的建立。雖然，目前干細(xì)胞在環(huán)境污染物毒性評估方面的應(yīng)用仍處于探索階段，但其發(fā)展?jié)摿σ颜孤稛o遺[4-5,11]。

圖1 干細(xì)胞毒理學(xué)發(fā)展簡介Fig. 1 Development of stem cell toxicology

2 人多能干細(xì)胞在基礎(chǔ)毒性評估中的應(yīng)用(The application of hESCs in basic toxicity evaluation)

在現(xiàn)代毒理學(xué)研究中，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)具有系統(tǒng)簡單、條件可控、實(shí)驗(yàn)周期短以及易于高通量化等特點(diǎn)。相比于癌細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞具有正常的核型，在基礎(chǔ)毒性測試中能夠更加客觀地反映化合物與正常細(xì)胞之間的作用；相比于原代細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞的增殖能力更強(qiáng)，通過誘導(dǎo)分化可以大量獲得不同原代細(xì)胞的替代品，為實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的高通量化創(chuàng)造條件。胚胎干細(xì)胞在基礎(chǔ)毒性檢測中的應(yīng)用可以追溯到1991年，Laschinski等[3]從囊胚中分離出整倍體mESCs，隨后使用MTT法同時(shí)檢測了多種化合物對mESCs和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性，相關(guān)測試結(jié)果不僅與之前活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度吻合，還顯示mESCs比已分化細(xì)胞具有更高的敏感性。隨著hPSCs培養(yǎng)體系的建立以及誘導(dǎo)分化技術(shù)的不斷突破，hPSCs以及其分化而來的細(xì)胞也被應(yīng)用于基礎(chǔ)毒性檢測當(dāng)中，并且毒性檢測方法也逐漸走向高通量化。2016年，Pei等[12]建立了一套基于hiPSCs和hiPSCs分化而來的細(xì)胞(神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞)的高通量化合物毒性篩查系統(tǒng)，隨后使用該系統(tǒng)研究了包括神經(jīng)毒素、發(fā)育神經(jīng)毒素和環(huán)境污染物在內(nèi)的80種化合物在10mol·L-1和100 μmol·L-1時(shí)的毒性。MTT細(xì)胞毒性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在被測試的80種化合物中，有50種化合物對上述4種細(xì)胞中的至少一種具有細(xì)胞毒性，其中纈霉素、四溴雙酚A、溴氰菊酯和磷酸三苯酯對4種細(xì)胞均具有顯著的細(xì)胞毒性。可見，使用胚胎干細(xì)胞分化系統(tǒng)，便于建立基于各種不同類型細(xì)胞的高通量化毒性篩查平臺(tái)，可以極大地推進(jìn)化合物毒性敏感階段和靶點(diǎn)細(xì)胞的確定。同時(shí)，環(huán)境污染物四溴雙酚A、溴氰菊酯和磷酸三苯酯相比于其他已知神經(jīng)毒劑具有更廣泛的毒性效應(yīng)，說明了使用基于hPSCs和不同分化細(xì)胞的高通量毒性篩查平臺(tái)進(jìn)行環(huán)境污染物基礎(chǔ)毒性篩查的必要性。

3 人多能干細(xì)胞在發(fā)育毒性評估中的應(yīng)用(The application of hESCs in developmental toxicity evaluation)

干細(xì)胞毒理學(xué)研究除了關(guān)注化合物對細(xì)胞活力、胞內(nèi)活性氧自由基水平和胞膜完整性等基礎(chǔ)毒性指標(biāo)之外，更關(guān)注化合物在非致死濃度下對干細(xì)胞自我更新能力、分化潛能以及分化過程的影響。而且，hPSCs分化模型也是目前直接研究化合物對人早期胚胎發(fā)育作用的唯一有效模型。1997年，Spielmann等[4]在基于mESCs的胚胎發(fā)育毒性檢測方法中引入了擬胚體(embryoid bodies, EBs)分化實(shí)驗(yàn)，在EBs分化過程中給藥處理，隨后根據(jù)分化末期跳動(dòng)EBs的數(shù)量來評估化合物對分化實(shí)驗(yàn)效率的影響，該實(shí)驗(yàn)方法即為胚胎干細(xì)胞在發(fā)育毒性評估中的應(yīng)用雛形。hPSCs分化模型的建立為發(fā)育毒性研究提供了多種可選方向，使人們能夠全面地解析某個(gè)或某類化合物對胚胎干細(xì)胞不同分化過程的影響，有利于揭示化合物胚胎發(fā)育毒性的靶向性及致毒機(jī)制。

3.1 人多能干細(xì)胞在環(huán)境污染物神經(jīng)發(fā)育毒性評估中的應(yīng)用(The application of hESCs in developmental neural toxicity evaluation)

目前，基于hPSCs的神經(jīng)、肝臟、心臟、胰腺和皮膚發(fā)育毒性的研究均有報(bào)道，其中，神經(jīng)系統(tǒng)最容易受到外界因素干擾，因而成了胚胎干細(xì)胞發(fā)育毒性研究的熱點(diǎn)[13-14]。神經(jīng)系統(tǒng)是動(dòng)物和人類進(jìn)行思考、行為和生理活動(dòng)的調(diào)控樞紐，發(fā)育過程極其復(fù)雜，需要有程序地進(jìn)行神經(jīng)元的發(fā)生、神經(jīng)元的遷移、突起長出和突觸連接形成等過程，耗時(shí)長達(dá)數(shù)年。已報(bào)道的相關(guān)神經(jīng)發(fā)育毒性研究涉及神經(jīng)叢形成[15]、神經(jīng)前體發(fā)育[16]和多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育等各個(gè)過程[17-18]。

2019年，Chen等[19]使用hPSCs神經(jīng)分化系統(tǒng)，研究了溴代阻燃劑多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)同系物BDE-47和BDE-99對人早期神經(jīng)發(fā)育不同階段的影響。該研究將hPSCs神經(jīng)分化過程分為hESC自我更新、EB三胚層形成、EB外胚層至神經(jīng)叢形成、神經(jīng)前體增殖和神經(jīng)球擴(kuò)張等5個(gè)階段。分段式的研究結(jié)果顯示，神經(jīng)前體階段的細(xì)胞對PBDEs引起的細(xì)胞毒性較為敏感，并且在亞致死濃度下，BDE-47即可抑制神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)的增殖和神經(jīng)元的生成。隨后，轉(zhuǎn)錄組和甲基化組學(xué)分析顯示，PBDEs暴露影響細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期、激素信號、類固醇代謝和神經(jīng)發(fā)育等生理過程，并且導(dǎo)致CpG甲基化顯著增加。該研究表明，運(yùn)用hPSCs神經(jīng)分化系統(tǒng)分段式的研究，有利于找出化合物作用的敏感時(shí)期，并且大量的組學(xué)數(shù)據(jù)也為全面揭示PBDEs的毒性效應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

目前，基于hPSCs的神經(jīng)發(fā)育毒性研究，因?yàn)榉只椒ǖ牟煌N類繁多。然而，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)都只是獨(dú)立地研究特定化合物對特定神經(jīng)分化過程的影響，如何形成一套完整的發(fā)育神經(jīng)毒性評價(jià)體系以及如何整合已有研究成果，從而形成各種化合物的結(jié)構(gòu)-神經(jīng)毒性效應(yīng)體系，是該研究方向面臨的一大挑戰(zhàn)。

3.2 人多能干細(xì)胞在環(huán)境污染物肝臟發(fā)育毒性評估中的應(yīng)用(The application of hESCs in developmental hepatic toxicity evaluation)

肝臟是人體至為重要的解毒器官，在解毒的同時(shí)，往往會(huì)因?yàn)榛衔锏睦鄯e，給自身帶來損傷。以往的大多數(shù)研究只關(guān)注化合物對肝臟或肝細(xì)胞的影響，而很少關(guān)注胚胎發(fā)育時(shí)期化合物暴露對肝臟發(fā)育的影響。然而，近年來基于小鼠模型的研究顯示，胚胎發(fā)育時(shí)期內(nèi)分泌干擾物的暴露會(huì)增加后天患非酒精性脂肪肝病的風(fēng)險(xiǎn)，表明胚胎發(fā)育時(shí)期化合物暴露造成的影響同樣不可小覷[20]。

目前，Liang等[21]已建立一套基于hPSCs肝臟分化模型的毒性檢測系統(tǒng)。使用甲狀腺素T3和T4作為陽性化合物對該系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，該系統(tǒng)可以很好地反映過量甲狀腺素處理對肝臟細(xì)胞分化造成的影響，具體表現(xiàn)為分化末期細(xì)胞內(nèi)脂肪的大量積累和糖原貯存能力偏低。同樣，在上述研究中，研究者還研究了與甲狀腺素結(jié)構(gòu)類似的環(huán)境污染物BDE-47和BDE-209對肝臟分化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PBDEs和甲狀腺激素處理均能夠促進(jìn)CYP家族(CYP1A1、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4和CYP3A7)肝臟標(biāo)志基因的表達(dá)，但對PPARA和HNF4A等基因的作用相反，可見PBDEs和甲狀腺激素對肝臟發(fā)育的影響有類似之處，但又不完全相同，暗示PBDEs還影響肝臟分化過程中的其他關(guān)鍵靶點(diǎn)[21]。該研究為揭示PBDEs的人體肝臟發(fā)育毒性提供了線索。上述研究系統(tǒng)是目前已報(bào)道的首個(gè)基于hPSCs的肝臟發(fā)育毒性評估系統(tǒng)，但該系統(tǒng)的應(yīng)用目前仍不成熟，將來更多檢測終點(diǎn)的加入有望使該系統(tǒng)不斷完善，最終成為一套全面的肝臟發(fā)育毒性評估系統(tǒng)。

3.3 人多能干細(xì)胞在環(huán)境污染物心臟發(fā)育毒性評估中的應(yīng)用(The application of hESCs in developmental cardiac toxicity evaluation)

心臟是人體的泵血器官，先天性心臟畸形是較為普遍的先天性畸形病癥，全世界每年有約1%的新生兒患有該病[22-23]，然而先天性心臟病的病因往往難以明確。目前，已知孕期藥物和環(huán)境污染物的暴露會(huì)增加新生兒罹患先天性心臟病的風(fēng)險(xiǎn)，因此，近年已有研究建立了基于hPSCs的心臟發(fā)育毒性檢測系統(tǒng)，并以二惡英類化合物2,3,7,8-TCDD為例，研究了環(huán)境污染物的心臟發(fā)育毒性[24]。該研究同樣采取了分段式的研究方法，研究了在胚胎干細(xì)胞、中胚層、心臟中胚層、心肌前體或心肌細(xì)胞階段TCDD處理對心臟分化的影響。結(jié)果顯示，在胚胎干細(xì)胞階段或中胚層階段TCDD的暴露會(huì)顯著抑制心臟分化。后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析和染色質(zhì)免疫沉淀測序分析(ChIP-seq)結(jié)果表明，TCDD在hPSCs分化早期會(huì)作用于芳香烴受體(AhR)，促使其與基因組DNA的反式作用元件結(jié)合，抑制中胚層相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制心臟分化。該研究結(jié)論與利用動(dòng)物模型和小鼠細(xì)胞模型得到的研究結(jié)果一致[24]，證明了使用該系統(tǒng)研究化合物對人胚胎心臟發(fā)育過程的影響是可行的。

3.4 人多能干細(xì)胞在環(huán)境污染物胰腺發(fā)育毒性評估中的應(yīng)用(The application of hESCs in developmental pancreatic toxicity evaluation)

胰腺是人體內(nèi)具有外分泌和內(nèi)分泌功能的重要器官，與消化和糖代謝密切相關(guān)。胰腺發(fā)育相關(guān)研究在哺乳動(dòng)物中難以進(jìn)行，因此，往往需要依賴斑馬魚等脊椎動(dòng)物模型[25]。hPSCs胰腺分化方法的突破為人胰腺發(fā)育毒性的研究提供了一個(gè)新思路。目前，Liu等[26]已初步建立了基于hPSCs胰腺分化的胰腺發(fā)育毒性研究系統(tǒng)，并研究了持久性有機(jī)污染物全氟辛基羧酸(PFOA)和全氟辛基磺酸(PFOS)的胰腺發(fā)育毒性。結(jié)果表明，低至5 nmol·L-1的PFOA和PFOS處理就會(huì)抑制胰腺分化，具體表現(xiàn)在抑制了胰腺分化過程中內(nèi)胚層標(biāo)志基因(FOXA1、FOXA2、SOX7和SOX17)和胰腺相關(guān)重要轉(zhuǎn)錄因子(HNF1b、HNF4a、HNF6、PDX1和SOX9)的表達(dá)。該結(jié)果與已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果和流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果相吻合[27-31]，暗示PFOA和PFOS干擾人胚胎發(fā)育早期階段胰腺發(fā)育[26]。上述研究表明，基于胚胎干細(xì)胞的胰腺分化模型可以方便、快捷并靈敏地反映極低劑量環(huán)境污染物誘發(fā)的胰腺發(fā)育毒性[26]，該胰腺發(fā)育毒性模型的發(fā)展和完善將極大地推進(jìn)化合物胰腺發(fā)育毒性的研究。

3.5 人多能干細(xì)胞在環(huán)境污染物皮膚發(fā)育毒性評估中的應(yīng)用(The application of hESCs in developmental skin toxicity evaluation)

表皮是皮膚對外的屏障，可以起到阻止外界病原入侵、抵御輻射和防止機(jī)體水分丟失等作用[32]。表皮中90%的細(xì)胞是角質(zhì)形成細(xì)胞，正常狀態(tài)下，角質(zhì)形成細(xì)胞可以自我更新、增殖并修復(fù)受損的表皮，而病理狀態(tài)下角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮性水皰、牛皮癬等皮膚炎癥作用的靶點(diǎn)[33]。目前，有關(guān)化合物的皮膚發(fā)育毒性的相關(guān)研究非常匱乏，Cheng等[34]建立了基于hPSCs分化的皮膚發(fā)育毒性檢測模型，并研究了空氣污染物超細(xì)碳顆粒物對皮膚發(fā)育的影響。結(jié)果表明，超細(xì)碳顆粒物暴露使角質(zhì)形成細(xì)胞前體相關(guān)基因KRT8、KRT18和ΔNP63表達(dá)水平上升，成熟相關(guān)基因KRT14、KRT5、KRT16和COL7A1表達(dá)水平下降，同時(shí)，使牛皮癬相關(guān)基因S100A7、S100A9和炎癥相關(guān)因子表達(dá)水平顯著上升。上述結(jié)果顯示，超細(xì)碳顆粒物可以影響表皮發(fā)育過程，增加表皮炎癥疾病的發(fā)病率[34]。該研究顯示了空氣污染對嬰幼兒皮膚發(fā)育的潛在影響，為揭示超細(xì)碳顆粒的毒性效應(yīng)提供了幫助。同時(shí)，該研究也是人體皮膚發(fā)育毒性研究的初探，在將來，表觀遺傳組等各種組學(xué)技術(shù)與皮膚發(fā)育毒性研究的結(jié)合或許能夠揭示環(huán)境污染與人體皮膚敏感性的關(guān)聯(lián)。

目前，在生命科學(xué)領(lǐng)域，與干細(xì)胞相關(guān)的誘導(dǎo)分化方法層出不窮，基于誘導(dǎo)分化而形成的細(xì)胞的自動(dòng)化、高通量毒性研究方法也逐漸增多。然而，如何利用多能干細(xì)胞的優(yōu)勢來評估環(huán)境污染物對人胚胎早期發(fā)育過程的影響依舊是一個(gè)亟待探索的領(lǐng)域。由于人體發(fā)育過程本身的復(fù)雜性，每個(gè)發(fā)育階段都存在著多種細(xì)胞類型和復(fù)雜的生命活動(dòng)，如何通過眾多的誘導(dǎo)分化手段在體外模擬人胚胎分化到某個(gè)特定階段的過程，又如何將同種化合物在獨(dú)立研究中取得的毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，最終準(zhǔn)確預(yù)測化合物的靶點(diǎn)和致毒機(jī)制，是該領(lǐng)域面臨的一大挑戰(zhàn)。

4 人多能干細(xì)胞在器官毒性評估中的應(yīng)用(The application of hESCs in organ toxicity evaluation)

隨著胚胎干細(xì)胞不同誘導(dǎo)分化方法的發(fā)展，研究人員開始嘗試使用分化而來的細(xì)胞構(gòu)建高仿真3D組織。在過去幾年里，出現(xiàn)了2種不同的技術(shù)來模擬體內(nèi)器官的真實(shí)情況：(1)依賴干細(xì)胞生物學(xué)的自組織類器官技術(shù)；(2)依賴生物工程手段的器官芯片技術(shù)。3D類器官是與對應(yīng)的器官具有類似的空間組織和功能的三維細(xì)胞培養(yǎng)物。類器官技術(shù)首先通過不同的方法誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化，獲得處于特定發(fā)育階段的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，隨后將這些細(xì)胞按照某種特定方式混合，使其自組裝并且發(fā)育形成類器官。一般通過單層分化得到的細(xì)胞都處于未成熟的狀態(tài)，然而，一系列研究表明，使用分化到某一特定階段的細(xì)胞自組裝構(gòu)建出的類器官內(nèi)的細(xì)胞往往更為成熟，因此，3D類器官的基因表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)分泌以及細(xì)胞功能活動(dòng)更為接近體內(nèi)器官[35-37]，并且更適合進(jìn)行化合物的器官毒性研究。目前，可以構(gòu)建的類器官包括大腦[38]、心臟[39]、肝臟[40-41]、胰腺[42]、肺[43]、腎[44]、輸卵管[45]、視網(wǎng)膜[46]、角膜[47]、唾液腺[48]、子宮內(nèi)膜[49]和血管[50]等。部分人源類器官已經(jīng)被應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)或化合物毒性評估當(dāng)中。

在腦類器官方面，Schwartz等[51]將hPSCs分化而來的神經(jīng)前體細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞共同培養(yǎng)，使這些前體細(xì)胞自組裝成具有三維神經(jīng)結(jié)構(gòu)和血管網(wǎng)絡(luò)的腦類器官。隨后使用上述腦類器官檢測了包括環(huán)境污染物二惡英在內(nèi)的34種神經(jīng)毒劑和26種無毒化合物對基因表達(dá)譜的影響，并且應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法，根據(jù)有毒和無毒情況下腦類器官基因表達(dá)譜的變化，建立了基于計(jì)算機(jī)識(shí)別毒性特異基因表達(dá)譜的化合物神經(jīng)毒性評估模型。該研究不僅提供了一個(gè)可行的腦類器官構(gòu)建方法，還證明了通過計(jì)算機(jī)識(shí)別毒性特異基因表達(dá)譜的方法評估化合物毒性的可行性。相較于細(xì)胞活力，化合物在低濃度下往往首先影響基因的轉(zhuǎn)錄，因此，基于轉(zhuǎn)錄組分析的毒性篩查方法更加靈敏。隨著機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)的進(jìn)步和轉(zhuǎn)錄組測序成本的下降，計(jì)算機(jī)識(shí)別毒性特異基因表達(dá)譜的方法或能得以推廣，從而建立起一些高靈敏、高通量的毒性篩查系統(tǒng)。在心臟類器官方面，Mills等[52]已經(jīng)建立了高通量心臟類器官毒性評估系統(tǒng)，使用該系統(tǒng)研究了105種潛在的促再生小分子，并且成功地從中篩選出2種不會(huì)影響心臟功能的促再生分子，初步揭示了其促再生機(jī)理。在肝臟類器官方面，李朋彥等[53]使用3D肝臟類器官模型，研究了該模型對陽性對照物胺碘酮、環(huán)孢霉素和陰性對照藥物阿司匹林的不同反應(yīng)，初步證實(shí)了該系統(tǒng)在檢測肝臟毒性時(shí)的準(zhǔn)確性。在腎臟毒性方面，Czerniecki等[54]更是建立了一套全自動(dòng)化、高通量的腎臟類器官形成及腎毒性評估系統(tǒng)，使用該系統(tǒng)有望高效地進(jìn)行化合物腎毒性的研究。

雖然基于現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建的3D類器官還不能完美地模擬體內(nèi)成熟器官，但使用類器官代替人體臟器系統(tǒng)進(jìn)行研究是毒理學(xué)研究發(fā)展的趨勢之一。在不遠(yuǎn)的將來，類器官構(gòu)建技術(shù)的突破以及基于類器官的毒理學(xué)研究系統(tǒng)的高通量化，有望帶來人體器官毒性研究的飛躍。此外，目前人源類器官的應(yīng)用大多集中在藥物的開發(fā)上，而實(shí)際上環(huán)境污染物對人體健康的效應(yīng)同樣值得關(guān)注，因此，人源類器官模型在環(huán)境污染物器官毒性評估方面的應(yīng)用亟待開發(fā)。

器官芯片是通過微流控等生物工程學(xué)方法精確模擬體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)[55-56]。該領(lǐng)域最早的研究報(bào)道于2010年，Huh等[57]使用經(jīng)典的軟光刻技術(shù)和微流控技術(shù)創(chuàng)建了一個(gè)肺芯片，用來模擬人類肺泡毛細(xì)血管界面，使人們能夠模擬肺部炎癥和感染。近年來，器官芯片領(lǐng)域飛速發(fā)展，大量研究報(bào)道了各種器官芯片的構(gòu)建。胚胎干細(xì)胞相關(guān)技術(shù)的成熟為使用器官芯片進(jìn)行疾病特異性藥物的開發(fā)或人群特異性污染物毒性的評估提供了便利。同時(shí)，類器官技術(shù)與器官芯片技術(shù)的結(jié)合，也將使化合物的器官發(fā)育毒性的研究更上一層樓[58]。在研究環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)方面，器官芯片和類器官芯片有著極大的應(yīng)用空間。

5 總結(jié)與展望(Summary and prospects)

近年來，干細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展為環(huán)境污染物毒性的體外研究提供了許多有利條件和新的途徑。通過擴(kuò)增胚胎干細(xì)胞并且誘導(dǎo)其分化，可以大量獲得特定類型的細(xì)胞，從而解決某些原代細(xì)胞難以大量增殖的問題，為環(huán)境污染物毒性評估的高通量化奠定了基礎(chǔ)。使用胚胎干細(xì)胞分化來模擬人體胚胎發(fā)育的過程，可以在體外研究環(huán)境污染物的人體胚胎發(fā)育毒性，從而獲得相比于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更加接近人體發(fā)育過程的毒性數(shù)據(jù)。使用胚胎干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞構(gòu)建類器官，可以建立起更加接近人體內(nèi)真實(shí)情況的器官毒性評價(jià)體系，實(shí)現(xiàn)人體器官毒性的體外評估。同時(shí)，多種毒性評估方法的應(yīng)用，又將有助于全方位地評估環(huán)境污染物對人體各種細(xì)胞、組織、器官和發(fā)育過程的影響，進(jìn)而全面揭示其致毒機(jī)制。目前，多數(shù)基于干細(xì)胞模型的環(huán)境污染物毒性研究都是獨(dú)立進(jìn)行的，使用的模型和研究對象也各不相同，如何將相關(guān)研究結(jié)果進(jìn)行整合分析，并總結(jié)出某類化合物的毒性靶點(diǎn)和毒性規(guī)律是現(xiàn)階段需要解決的一大難題。未來，把基于干細(xì)胞的各種細(xì)胞毒性、發(fā)育毒性和器官毒性研究方法進(jìn)行整合，建立一套完整的干細(xì)胞毒理學(xué)評價(jià)體系并實(shí)現(xiàn)高通量化，將是一項(xiàng)極其龐大而又意義深遠(yuǎn)的工程。毋庸置疑，干細(xì)胞毒理學(xué)的發(fā)展能夠有力地推進(jìn)環(huán)境污染物的毒性評估。基于現(xiàn)有的研究結(jié)果，人們有望在將來建立一套化合物結(jié)構(gòu)-毒性效應(yīng)關(guān)系體系，用以指導(dǎo)安全化合物的合成。