佳樂麝香對斑馬魚胚胎甲狀腺激素的影響

李明，尹曉宇，陳浩，王歡，宋磊，董文靜，趙寶全，于永利,3,#，董武,#，楊景峰,*

1. 內蒙古民族大學動物科學技術學院，內蒙古自治區毒物監控及毒理學重點實驗室，通遼 028000 2. 軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京100850 3. 內蒙古民族大學生命科學與食品學院，通遼 028000

天然麝香產量少，價格昂貴，目前市場上供應的麝香主要是合成麝香(synthetic musks)[1]。合成麝香不但廣泛用于日化用品，且在煙草以及動物飼料中也有添加。近年來，由于多環麝香(polycyclic musks, PMs)生產成本低，逐漸替代了市場中占據主導地位的硝基麝香(nitro-musks, NMs)[2]。PMs中佳樂麝香(galaxolide, HHCB)是用量較大，使用范圍較廣的合成麝香，研究發現，HHCB在109種個人護理品中的平均濃度約為958.19 μg·g-1[3]。而Lu等[4]針對158種個人護理品中合成麝香情況進行檢測，發現約82%的個人護理品中含有合成麝香，其中PMs中HHCB的檢出率達到了78%。HHCB成為皮膚接觸暴露最為嚴重的合成麝香，估算暴露量約為18～237 μg·d-1，更為嚴重的是，HHCB的使用殘留會造成一定的生物蓄積[4]。Wong等[5]在對城市和周邊環境中合成麝香進行檢測時發現，HHCB是室內空氣(0.30～18 ng·m-3)、室外空氣(0.99 ng·m-3)、地表水(0.031 ng·m-3)和廢水(1 000～1 800 ng·L-1)中含量最高的合成麝香。此外，Fromme等[6]在柏林地區檢測到污水處理廠廢水中HHCB的濃度甚至達到0.07～1.59 g·L-1。

隨著麝香類化合物的大量和廣泛使用，已經造成其在不同環境介質和生物體內大量蓄積，在河流、湖泊、淤泥、近海及人的脂肪和乳汁中都發現了合成麝香的殘留[7-12]，對水生生物和人類健康造成潛在威脅。PMs可導致斑馬魚胚胎發育遲緩、體軸彎曲、心率降低及血管通透性改變甚至消失等現象[13-14]。Pablos等[15]認為合成麝香可導致非洲爪蟾(Xenopuslaevis)甲狀腺上皮細胞肥大以及甲狀腺激素調節的紊亂，甲狀腺素是甲狀腺濾泡細胞分泌的一種重要的活性物質，可影響胚胎發育、孵化以及心臟機能的改變[16]。甲狀腺機能亢進會造成動物全身血管阻力下降、心率上升、射血分數增加和心輸出量增加，甲狀腺機能減退表現出與之相反的癥狀，嚴重者甚至引發心包積液，造成心臟壓塞[17-20]。

斑馬魚(Daniorerio)是一種小型熱帶淡水魚，因其體型小便于繁育和操作、早期發育通體透明容易觀察，同時對很多化學物質非常敏感等諸多優點，成為一種優良的模式動物[21-22]。在藥物篩選、胚胎發育和疾病研究中被廣泛使用[23-31]。已成為生命科學研究中重要的生物疾病模型。本研究以斑馬魚作為模式動物，探討HHCB對斑馬魚胚胎發育的影響，特別是對甲狀腺激素及關聯基因的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

試驗動物：斑馬魚(Daniorerio)，AB系，飼養于循環水養殖系統(北京愛生科技發展公司)，雌雄魚分開飼喂，光照周期為14 h∶10 h。養殖溫度保持在(28.5±1) ℃，pH保持在7.0～7.6，電導率保持在440～640 μS。繁殖時選取健康的成年斑馬魚按照雌雄魚1∶2的比例放入交配缸中，待第2天早上，斑馬魚見光產卵，30 min后即可獲得受精卵。清洗受精卵后，在體式顯微鏡下挑出受精后2～4 h (hours post fertilization, hpf)健康的同期斑馬魚胚胎進行實驗。

實驗試劑：佳樂麝香，分子量258.40，純度為50%，CAS號為1222-05-5，購自東京化成工業株式會社。總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒和二甲基亞砜(DMSO)(分析純)等均購自于美國Sigma公司。

1.2 佳樂麝香對斑馬魚胚胎的暴露

HHCB暴露實驗分別設有對照組(體積分數為0.1%的DMSO)和HHCB實驗組，參照HHCB環境濃度0.07～1.59 g·L-1(258.4 mg·L-1=1 mmol·L-1)[5]和預實驗結果，HHCB實驗組濃度設為：0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.1和0.2 mmol·L-1(1.292、2.584、5.168、7.752、10.336、25.84和51.68 mg·L-1)，HHCB用助溶劑DMSO稀釋后制成HHCB實驗液。選取2～4 hpf的斑馬魚胚胎隨機分配到六孔板中，每孔10枚斑馬魚胚胎，每組設置5個平行，每孔加入5 mL斑馬魚胚胎培養液和5 μL HHCB實驗液(對照組加入5 μL DMSO)，將胚胎置于28 ℃恒溫培養箱(型號51031566，美國Thermo Fisher Scientific公司)中培養。

1.3 斑馬魚胚胎發育毒性檢測

HHCB暴露后，在體式顯微鏡(M205a，德國Leica)下觀察并記錄24、48、72、96和120 hpf時期斑馬魚胚胎的死亡、孵化和心臟發育狀況。

1.4 斑馬魚胚胎心囊面積測定

根據斑馬魚胚胎死亡率結果，確定HHCB實驗組濃度為：0.005、0.01、0.02、0.03和0.04 mmol·L-1(1.292、2.584、5.168、7.752和10.336 mg·L-1)。在體式顯微鏡下，觀察和拍攝72 hpf和96 hpf各組斑馬魚胚胎的心臟發育形態，并使用Image J圖像軟件定量分析斑馬魚心囊面積，每個實驗組測量6個樣本，統計分析不同實驗組斑馬魚胚胎心囊面積之間的差異。

1.5 總RNA的提取以及基因表達的相對定量(RT-qPCR)

結合前期實驗結果，RT-qPCR實驗中HHCB暴露濃度設為：0.005、0.01和0.02 mmol·L-1(1.292、2.584和5.168 mg·L-1)，將斑馬魚胚胎分別培育到24、48和72 hpf，清洗掉培養液后收集到1.5 mL離心管中，進行總RNA提取，RNA反轉錄成cDNA后，以Gapdh為內參基因，進行RT-qPCR的定量分析，實驗方法與步驟參照Dong等[32]的方法。引物序列見表1采用2-△△CT方法計算基因表達的相對變化。

1.6 佳樂麝香對斑馬魚甲狀腺激素的影響

挑選2～4 hpf斑馬魚胚胎進行實驗，設置成對照組與0.005、0.01和0.02 mmol·L-1(1.292、2.584和5.168 mg·L-1) HHCB共4個處理組，每個處理3個平行，每組100枚胚胎。在平皿中培養至72 hpf，用1×PBS進行沖洗3遍，將胚胎收集到1.5 mL的離心管中，添加400 μL的1×PBS，快速勻漿后在超高速冷凍離心機(5420R，德國Eppendorf)4 ℃和12 000 r·s-1的條件下，離心5 min，取3次100 μL上清液，分裝在新的1.5 mL的離心管中，用ELISA試劑盒檢測總四碘甲狀腺原氨酸(TT4)和總三碘甲狀腺原氨酸(TT3)的含量。

1.7 統計方法

實驗數據統計使用Graphpad Prism 5和SPSS.20分析軟件，進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05時表示差異具有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 佳樂麝香對斑馬魚死亡率的影響

在24、48、72、96和120 hpf時，統計HHCB對斑馬魚胚胎造成的死亡情況，表現為顯著的濃度依存性和時間依存性。檢測對照組的死亡率為0，而隨著暴露時間和暴露濃度的增加，HHCB實驗組的斑馬魚胚胎死亡率也逐漸升高。0.1 mmol·L-1和0.2 mmol·L-1(25.84 mg·L-1和51.68 mg·L-1)HHCB實驗組在24 hpf出現死亡，培養到48 hpf引起100%的死亡(圖1) (P<0.001)。在72 hpf時，0.04、0.1和0.2 mmol·L-1(10.336、25.84和51.68 mg·L-1)組的死亡率分別為70%、100%和100%，與對照組相比差異顯著(P<0.001)。在96 hpf時，0.03 mmol·L-1組死亡率為18%(P<0.05)，0.04、0.1和0.2 mmol·L-1(10.336、25.84和51.68 mg·L-1)組的死亡率與對照組相比差異顯著(P<0.001)。在120 hpf時，與對照組相比，0.01、0.02、0.03、0.04、0.1和0.2 mmol·L-1(2.584、5.168、7.752、10.336、25.84和51.68 mg·L-1)組的死亡率差異顯著(P<0.001)。使用SPSS.20計算出24、48、72、96和120 hpf HHCB的LC50分別為0.076、0.053、0.046、0.037和0.008 mmol·L-1(19.638、13.695、11.886、9.561和2.067 mg·L-1)。

表1 RT-qPCR的引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

圖1 不同濃度佳樂麝香(HHCB)暴露對斑馬魚胚胎(幼魚)死亡率的影響注：星號(*)表示HHCB實驗組與對照組之間的顯著差異(*P<0.05，***P<0.001；n=10)。Fig. 1 Mortality rate of zebrafish embryos (larvae) in galaxolide (HHCB) treatments with different concentrationsNote: The asterisk (*) indicates significant difference between the HHCB experimental groups and the control group (* P<0.05, ***P<0.001; n=10).

2.2 佳樂麝香對斑馬魚孵化率的影響

在72 hpf時，統計對照組與0.005、0.01、0.02、0.03和0.04 mmol·L-1(1.292、2.584、5.168、7.752和10.336 mg·L-1)HHCB實驗組斑馬魚胚胎的孵化率(圖2)。結果顯示，對照組、0.005 mmol·L-1和0.01 mmol·L-1(1.292 mg·L-1和2.584 mg·L-1)HHCB實驗組的孵化率均為100%。而隨著HHCB暴露濃度的增加，0.02、0.03和0.04 mmol·L-1(5.168、7.752和10.336 mg·L-1)HHCB實驗組斑馬魚的孵化率分別為26.67%、3.33%和0%，均顯著低于對照組的孵化率(P<0.001)。

圖2 不同濃度HHCB暴露對斑馬魚胚胎(幼魚)孵化率的影響注：星號(*)表示HHCB實驗組與對照組之間有顯著差異(***P<0.001；n=10)。Fig. 2 Effect of HHCB treatment on hatching rate of zebrafish embryos (larvae)Note: The asterisk (*) indicates significant difference between the HHCB experimental groups and the control group (***P<0.001; n=10).

2.3 佳樂麝香對斑馬魚胚胎(或幼魚)心率的影響

在48 hpf和72 hpf時，分別統計對照組與0.005、0.01、0.02、0.03和0.04 mmol·L-1(1.292、2.584、5.168、7.752和10.336 mg·L-1)HHCB實驗組斑馬魚胚胎(或幼魚)的心率(times·min-1)。結果顯示，隨著HHCB暴露濃度的增加，HHCB實驗組的心率呈濃度依賴性降低(圖3)。在48 hpf時，0.01～0.04 mmol·L-1HHCB實驗組斑馬魚心率顯著降低了33.14%～62.73% (P<0.001) (圖3(a))。在72 hpf時，0.01 mmol·L-1(2.584 mg·L-1) HHCB實驗組斑馬魚心率與對照組相比有顯著差異(P<0.05)，0.02、0.03和0.04 mmol·L-1(5.168、7.752和10.336 mg·L-1) HHCB實驗組斑馬魚心率顯著降低了44.28%、26.20%和16.87%(P<0.001) (圖3(b))。

圖3 不同濃度HHCB暴露對斑馬魚胚胎(幼魚)心率的影響注：星號(*)表示HHCB實驗組與對照組之間的顯著差異(* P<0.05，***P<0.001；n=10)。Fig. 3 Effect of HHCB treatment on heart rate of zebrafish embryos (larvae)Note: The asterisk (*) indicates significant difference between the HHCB experimental groups and the control group (* P<0.05, ***P<0.001; n=10).

2.4 佳樂麝香對斑馬魚心囊面積的影響

在72 hpf和96 hpf時，對斑馬魚幼魚心囊進行拍攝(圖4(a)～(d))，定量分析每個處理組斑馬魚的心囊面積。在72 hpf時，與對照組相比，0.02、0.03和0.04 mmol·L-1(5.168、7.752和10.336 mg·L-1)HHCB實驗組斑馬魚幼魚的心囊面積顯著增加了1.96倍、2.26倍和2.14倍(P<0.001) (圖4(e))。在96 hpf時，0.02 mmol·L-1和0.03 mmol·L-1(5.168 mg·L-1和7.752 mg·L-1) HHCB實驗組斑馬魚幼魚的心囊面積顯著增加了3.17倍和3.02倍(P<0.001)，0.04 mmol·L-1(10.336 mg·L-1)HHCB實驗組斑馬魚幼魚的心囊面積是對照組的2.22倍(P<0.05) (圖4(f))。

圖4 不同濃度的HHCB暴露對斑馬魚胚胎(幼魚)心囊的影響注：(a) 72 hpf二甲基亞砜(DMSO)溶劑對照組；(b) 72 hpf 0.005 mmol·L-1 HHCB組；(c) 72 hpf 0.01 mmol·L-1 HHCB組；(d) 72 hpf 0.02 mmol·L-1 HHCB組；(e) 72 hpf；(f) 96 hpf；星號(*)表示HHCB實驗組與對照組之間的顯著差異(* P<0.05，***P<0.001；n=10)。Fig. 4 Effects of HHCB treatment on the pericardial cavity in zebrafish embryos (larvae)Note: (a) 72 hpf dimethylsulfoxide (DMSO) solvent control; (b) 72 hpf 0.005 mmol·L-1 HHCB; (c) 72 hpf 0.01 mmol·L-1 HHCB; (d) 72 hpf 0.02 mmol·L-1 HHCB; (e) 72 hpf; (f) 96 hpf; the asterisk (*) indicates significant difference between the HHCB experimental groups and the control group (* P<0.05, ***P<0.001; n=10).

2.5 佳樂麝香對斑馬魚甲狀腺激素關聯基因的影響

甲狀腺激素可影響魚類的孵化及心臟的跳動。筆者定量分析了甲狀腺激素相關基因的表達(圖5)，即甲狀腺激素受體α(Thrα)、甲狀腺激素受體β(Thrβ)、2型酪氨酸脫碘酶(Dio2)和3型酪氨酸脫碘酶(Dio3)。

圖5 不同濃度HHCB暴露對斑馬魚胚胎(幼魚)甲狀腺激素相關基因的影響注：星號(*)表示HHCB實驗組與對照組之間的顯著差異(* P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n=10)。Fig. 5 Effects of different HHCB treatment on the thyroid-related gene expressions of zebrafish embryos (larvae)Note: The asterisk (*) indicates significant difference between the HHCB experimental groups and the control group (* P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001; n=10).

HHCB暴露顯著影響斑馬魚胚胎Thrα和ThrβmRNA的表達量。在72 hpf時，0.005、0.01和0.02 mmol·L-1(1.292、2.584和5.168 mg·L-1) HHCB實驗組ThrαmRNA表達量分別是對照組的118.43%、62.15%和52.31%，0.02 mmol·L-1(5.168 mg·L-1) HHCB實驗組ThrαmRNA表達量顯著低于對照組(P<0.05) (圖5(a))。在96 hpf時，0.005、0.01和0.02 mmol·L-1(1.292、2.584和5.168 mg·L-1) HHCB實驗組ThrαmRNA表達量分別是對照組的160.93%、63.94%和59.21%，0.005 mmol·L-1(1.292 mg·L-1) HHCB實驗組顯著高于對照組(P<0.01)，0.01 mmol·L-1和0.02 mmol·L-1(2.584 mg·L-1和5.168 mg·L-1)HHCB實驗組顯著低于對照組(P<0.05) (圖5(b))。與Thrα類似，在72 hpf時，0.005、0.01和0.02 mmol·L-1(1.292、2.584和5.168 mg·L-1)組ThrβmRNA表達量分別是對照組的229.99%、128.85%和56.69%，0.005 mmol·L-1HHCB實驗組顯著高于對照組(P<0.001)，0.02 mmol·L-1(5.168 mg·L-1) HHCB實驗組顯著低于對照組(P<0.05) (圖5(c))。在96 hpf時，0.005、0.01和0.02 mmol·L-1(1.292、2.584和5.168 mg·L-1)組ThrβmRNA表達量分別是對照組的119.34%、99.70%和37.28%，0.02 mmol·L-1(5.168 mg·L-1) HHCB實驗組顯著低于對照組(P<0.01) (圖5(d))。

HHCB暴露對Dio2和Dio3 mRNA表達量的影響呈現下降趨勢。在72 hpf和96 hpf時，0.02 mmol·L-1(5.168 mg·L-1)組Dio2 mRNA表達量分別是對照組的42.83%(P<0.01)和35.64%(P<0.05)，顯著低于對照組(圖5(e)和圖5(f))。Dio3 mRNA表達在72 hpf時，0.005、0.01和0.02 mmol·L-1(1.292、2.584和5.168 mg·L-1)組Dio3 mRNA表達量與對照組相比差異顯著，Dio3 mRNA表達量分別是對照組的218.11%(P<0.001)、125.44%(P<0.05)和69.09%(P<0.01) (圖5(g))。在96 hpf時，0.005 mmol·L-1和0.01 mmol·L-1(1.292 mg·L-1和2.584 mg·L-1)組ThrβmRNA表達量與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，0.02 mmol·L-1(5.168 mg·L-1)組ThrβmRNA表達量是對照組的55.82%(P<0.05) (圖5(h))。

2.6 佳樂麝香對斑馬魚三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸(T4)的影響

HHCB暴露影響72 hpf斑馬魚體內總T3(TT3)和總T4(TT4)的含量如圖6所示。0.005 mmol·L-1(1.292 mg·L-1) HHCB處理組TT3含量與對照組比差異顯著(P<0.001)，0.01 mmol·L-1和0.02 mmol·L-1(2.584 mg·L-1和5.168 mg·L-1) HHCB實驗組TT3含量與對照組無顯著差異(P>0.05) (圖6(a))。與TT3含量相比，HHCB實驗組的TT4含量與對照組相比均顯著降低(P<0.001)，0.005、0.01和0.02 mmol·L-1(1.292、2.584和5.168 mg·L-1) HHCB實驗組TT4含量分別是對照組的77.69%、93.00%和87.67%(P<0.001) (圖6(b))。

3 討論(Discussion)

護理品中含有大量的HHCB類物質，使用后通常會被排入到自然環境中，難以自然降解[33]。包括HHCB在內的PMs，對水生生物的早期發育均造成嚴重的毒性影響[34-36]。本研究發現，低于環境濃度的HHCB對斑馬魚胚胎早期生長發育產生了嚴重影響，并造成甲狀腺激素關聯基因Thrα、Thrβ、Dio2和Dio3表達的變化，導致甲狀腺激素(TT3和TT4)含量變化，影響斑馬魚幼魚心率和心囊浮腫。

低濃度HHCB暴露對斑馬魚幼魚的生長發育具有顯著的急性毒性效應，這與Yamauchi等[37]報道相似，HHCB對青鳉魚早期生命階段具有顯著的急性毒性效應。隨著HHCB濃度的增加，斑馬魚胚胎的死亡率逐漸升高，且72 hpf的孵化率由0.01 mmol·L-1(2.584 mg·L-1) HHCB實驗組的100%降低到0.04 mmol·L-1(10.336 mg·L-1) HHCB實驗組的0%，都表現出顯著的濃度依存性。另外，HHCB對斑馬魚心臟的影響也非常突出，隨著HHCB暴露濃度的增加，心率呈規律性降低。斑馬魚的胚胎孵化和心臟發育都受到甲狀腺素的影響[38]，通過甲狀腺素的相關實驗也發現了類似結果。

圖6 不同濃度HHCB暴露對斑馬魚胚胎(幼魚)總三碘甲狀腺原氨酸(TT3)和總四碘甲狀腺原氨酸(TT4)含量的影響注：星號(*)表示HHCB實驗組與對照組之間的顯著差異(***P<0.001；n=10)。Fig. 6 Effects of different concentrations of HHCB treatments on total triiodothyronine (TT3) and total thyroxine (TT4) content in zebrafish embryos (larvae)Note: The asterisk (*) indicates significant difference between the HHCB experimental groups and the control group (***P<0.001; n=10).

甲狀腺的分泌調節會影響心臟的功能，甲狀腺功能減退會導致左心室舒張期舒張速率降低、心率降低和心臟收縮受損[39-41]，這與HHCB影響甲狀腺激素關聯基因表達量變化相關，也與導致心率下降的結果相吻合。為了進一步探究甲狀腺激素關聯基因與甲狀腺素之間的關聯，本文檢測了72 hpf斑馬魚TT4和TT3的含量。低濃度的HHCB(0.005 mmol·L-1、1.292 mg·L-1)暴露致使TT3顯著升高。但研究結果顯示，Dio3 mRNA表達量也顯著升高。這可能與機體的反饋調節有關。Dio3參與T3的轉化滅活，讓T3達到正常水平[16]。高濃度的HHCB(0.01 mmol·L-1(2.584 mg·L-1)以上)暴露沒有引起T3的升高，與TT4含量的降低和Dio2表達的低下有直接關聯。同時Thrα和Thrβ所有關聯基因表達的降低，說明HHCB造成了甲狀腺激素調節紊亂。在72 hpf，T4在斑馬魚體內開始產生，Dio2催化T4轉換為極強生物活性的T3[16]，而Dio2 mRNA表達量下降會造成斑馬魚孵化率的降低，發育遲緩，通過脫碘酶的基因敲低也證明了這一點[42]。

綜上所述，環境濃度的HHCB可造成斑馬魚胚胎甲狀腺激素分泌和調節紊亂。實驗證實斑馬魚胚胎可用于環境污染物的高通量監測，為確定污染物環境質量標準提供數據。