安乃近代謝產物4-乙酰氨基安替比林的水生急性毒性研究

劉敏，殷浩文，王綠平，王櫻芝，沈璐,朱慧

上海市檢測中心生物與安全檢測實驗室，上海 201203

安乃近具有較強的解熱鎮痛功效，很長一段時間內大量用于臨床治療。但是該藥具有較嚴重的毒副作用，比如，再生性貧血等，逐漸退出臨床用藥。發達國家如美國等禁止該藥用于食源性動物中。歐盟規定其在肌肉中的限量為200 μg·kg-1[1]。在我國，安乃近由于價格低廉，仍大量用于豬、牛等食源性動物疾病防控。2002年，我國也將其列入限制清單，規定其在食源性動物組織中的限量為200 μg·kg-1[2]。

安乃近具有快速水解特性，水解產物4-甲氨基安替比林(MAA)，安乃近的藥理作用主要通過MAA產生。MAA的代謝產物主要為4-甲酰氨基安替比林(FAA)和4-氨基安替比林(AA)，AA繼續代謝，并最終代謝為4-乙酰氨基安替比林(4-AAA)[3]。早在1967年，Banerjee等[4]發現奶牛的血漿和尿液中存在大量的4-AAA。Martínez-Piernas等[5]發現廢水中4-AAA濃度高達1.46 μg·L-1。采用此廢水澆灌的蘿卜和萵筍中的濃度為0.08～1.13 ng·g-1。Wiegel等[6]在歐洲中部的Elbe河中普遍檢測出高水平的4-AAA，其最高濃度達939 ng·L-1。筆者之前的研究也發現，在上海市水源中，4-AAA濃度高達344 ng·L-1[7]。

然而，目前缺乏有關4-AAA的生態毒性報道，無法對其生態風險進行評估。為此本研究采用經濟合作與發展組織(OECD)標準測試方法，從3個營養級水平，選取典型試驗生物藻、大型溞和魚，對其毒性效應進行評估，為后續生態風險評估提供數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

電子分析天平(Mettler Toledo AL204，梅特勒-托利多集團，瑞士)，電子分析天平(Mettler Toledo ME204E/02，梅特勒-托利多集團，瑞士)，智能光照空氣恒溫振蕩器(TS-211GZ，常州恒隆儀器有限公司，中國)，細胞顆粒計數器(Casy TT，Innovatis公司，德國)，手持式pH計(HANNA HI98128，哈納公司，意大利)，照度計(KIMO LX100，凱茂公司，法國)，偏光顯微鏡(Zeiss Axio Scope.A1，卡爾蔡司公司，德國)，溶解氧測定儀(Oxi7310，WTW公司，德國)，超高效液相色譜儀(Waters AcquityTMH-class/PDA eλDetection，沃特世公司，美國)，恒溫水浴槽(自制)。4-乙酰氨基安替比林，純度97%，購自百靈威(中國)；甲醇為色譜級，購自西格瑪公司；其余試劑均為分析純，購自國藥集團。

1.2 試驗生物

近頭狀偽蹄形藻引自中國科學院水生生物研究所。藻在實驗室培養，試驗前，在試驗條件下培養藻細胞3 d，試驗開始時，藻細胞處于對數生長期，濃度為1.09×106個·mL-1。2018年6月1日，用參比樣品重鉻酸鉀進行質量控制試驗，得72 h-ErC50值為1.00 mg·L-1(0.92～1.28 mg·L-1)，在可接受范圍之內((1.10±0.48) mg·L-1)[8]。

大型溞原種是引自MicroBioTests Inc.的大型溞休眠卵。試驗用大型溞為實驗室自行繁育的大型溞，經孤雌繁殖后所得的是溞齡小于24 h的非頭胎幼溞。其各世代大型溞均飼養于Elendt M4中，投喂柵藻(Desmodesmussubspicatus)和近頭狀偽蹄型藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)，每日一次，每個成體每日0.1～0.2 mg有機碳。2018年9月，用參比樣品重鉻酸鉀進行質量控制試驗。重鉻酸鉀的24 h-EC50為1.42 mg·L-1，在可接受的范圍內(0.6～2.1 mg·L-1)[9]。

稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)由上海市檢測中心生物與安全檢測實驗室自行繁育。試驗魚在試驗條件下已馴養14 d以上。馴養條件為：活性炭過濾、紫外滅菌的自來水，同時也用作試驗用水；21～25 ℃，變化不超過2 ℃；pH范圍為6.0～8.5；溶解氧濃度>80% ASV(即大于空氣中飽和氧含量的80%)；光照周期L∶D=12 h∶12 h；每天喂食豐年蝦薄片，試驗開始前24 h停止喂食。馴養期間未發現疾病。試驗開始前7天內試驗魚死亡率為0%。2018年6月，用參比樣品重鉻酸鉀進行質量控制試驗。重鉻酸鉀對稀有鮈鯽的96 h-LC50值為257 mg·L-1(95%置信限為207～309 mg·L-1)，在實驗室內部質量控制的標準之內(82.2～310 mg·L-1)。

1.3 急性毒性試驗

4-AAA的水生急性毒性通過藻類生長抑制試驗[10]、大型溞活動抑制試驗[11]以及魚類急性毒性試驗[12]進行評估。

1.3.1 溶液制備

稱取一定量的樣品直接溶解于各試驗用水中，避光連續磁力攪拌72 h，產生漩渦高度為樣品液柱高度的1/3，經0.45 μm硝酸纖維素膜過濾后配制成濃度為1 500 mg·L-1或3 000 mg·L-1的樣品母液。用試驗用水稀釋樣品母液，配制成各濃度的試驗溶液。

1.3.2 藻類生長抑制試驗

預試驗結果表明，1 500 mg·L-14-AAA暴露條件下，未觀察到明顯的生長抑制現象；因此，以1 500 mg·L-1的配制濃度進行限度試驗，試驗溶液體積100 mL，每組設6個平行。以藻類培養液作為空白對照組，設6個平行。藻細胞初始濃度約為104個·mL-1，試驗持續72 h。試驗條件為：22.8～23.1 ℃；培養基表面保持連續光照，光照強度4 988～5 554 lux；0 h和72 h，試驗溶液pH范圍分別為8.01～8.02和9.12～9.16。在試驗開始后0、24、48和72 h，從各樣品組中選取1個容器，從中各取2 mL試驗溶液用于濃度分析。試驗開始后0、24、48和72 h，對各試驗容器內的藻類數量和形態進行測定。

1.3.3 溞類急性運動抑制試驗

預試驗結果表明，1 000 mg·L-1的4-AAA對大型溞的活動存在明顯抑制；因此，開展系列濃度暴露的正式試驗。試驗開始前測得樣品母液(3 000 mg·L-1)pH值為6.78，不需要調節pH。用Elendt M4稀釋樣品母液，配制成各濃度試驗溶液。試驗設置1個空白對照組和5個暴露組，暴露組的配制濃度分別為188、375、750、1 500和3 000 mg·L-1。各組均設置4個平行，各平行試驗樣品體積為250 mL，試驗持續48 h，試驗方式為靜態。試驗用水硬度為145 mg·L-1；pH值6.68～7.01；溫度20.1～20.5 ℃；溶解氧濃度7.03～8.31 mg·L-1；光照周期L∶D=16 h∶8 h；每個平行5只溞，試驗期間不飼喂。在0、24和48 h分別觀察并記錄試驗幼溞的活動抑制數。在試驗開始和結束時從空白對照組和樣品組各選取1個容器分別取20 mL試驗溶液進行樣品濃度分析。

1.3.4 魚類急性毒性試驗

預試驗結果表明，1 500 mg·L-1暴露條件下，魚未發生死亡現象。以1 500 mg·L-1的配制濃度進行限度靜態試驗，試驗溶液體積4 L。同時設置空白對照組，不設平行。在每個試驗組容器中分別放入10尾試驗魚，試驗持續96 h，試驗期間不喂食。承載量約0.5 g·L-1(以魚體質量計)。溫度21.8～22.4 ℃；光照周期L∶D=12 h∶12 h；溶解氧為84.4%～91.2% ASV；pH 7.03～7.57。試驗開始和結束，分別從暴露組和空白組各取2 mL試驗溶液用于濃度分析。試驗結束時，試驗魚體長為(2.4±0.1) cm(Mean±SD)，體重為(0.24±0.04) g(Mean±SD)。

1.4 化學分析

采用超高效液相色譜對試驗溶液進行分析。首先對各試驗介質進行系統的方法驗證，主要包括線性范圍、回收率、精密度、檢測限和定量限。試驗開始和結束時，樣品測試中均添加加標樣品進行質量控制。分析條件如下：色譜柱為BEH C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)；檢測波長為257 nm；流動相流速0.4 mL·L-1，流動相為甲醇(A)和水(B)，梯度洗脫程序為初始比例V甲醇∶V水=98∶2，保持0.5 min，2 min內甲醇含量增加到30%，保持3 min，0.5 min之內回到起始點并平衡1.5 min。

1.5 數據統計

采用t-Test比較樣品組與空白對照組之間的平均特定生長率和生長量的差異，從而獲取無可觀察效應濃度(NOEC)和最低可觀察效應濃度(LOEC)值。采用Maximum Likelihood-Probit進行濃度效應擬合，計算效應濃度(ECx)。數據分析用軟件Toxcalc v5.0.32完成。

2 結果與討論(Results and disscussion)

2.1 濃度分析

對藻、溞和魚試驗各試驗基質中的分析方法均經過系統的方法驗證。線性范圍為0.0535～1.07 mg·L-1，線性方程為Y=1.07×104X+33.8，相關系數為0.9999。空白均不存在干擾，0.0642 mg·L-1和0.856 mg·L-1藻、溞和魚基質加標樣品的回收率分別為97.0%和96.3%、95.6%和95.1%、98.1%和99.5%；對應的精密度分別為1.49%和0.46%、0.84%和0.33%、1.30%和0.58%。方法檢測限和定量限均為0.0268 mg·L-1和0.0535 mg·L-1。質量控制樣品的回收率為99.8%～104%。

藻類抑制試驗、大型溞活動抑制試驗和魚類急性毒性試驗中，各試驗溶液的樣品實測濃度與配制濃度偏差均小于20%，分別-2.47%～2.80%、-8.27%～0.00%和2.00%～2.13%(表1)。

2.2 毒性效應

2.2.1 藻類生長抑制效應

空白對照組藻細胞濃度從1×104個·L-1增加到1.14×106個·L-1，增加至114倍(表2)；平均特定生長率1.58 d-1，空白對照組各時間段特定生長率的變異系數平均值為19.7%(表3)；整個試驗期間，空白對照組各平行的平均特定生長率的變異系數為2.31%。整個試驗滿足OECD 201質量控制要求[10]。

暴露組藻細胞濃度從1×104個·L-1增加到1.10×106個·L-1，增加至110倍；跟對照組相比，生長量抑制率為-13.5%～13.7%(表2)。平均特定生長率1.59 d-1，空白對照組各時間段特定生長率的變異系數平均值為17.6%；跟空白對照組進行比較，特定生長率抑制率為-2.53%～3.16%，平均抑制率僅為0.63%(表3)。統計結果表明，4-AAA對近頭狀偽蹄形藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)的72 h生長抑制效應，若以平均特定生長率和生長量表示，72 h-NOEC均≥1 502 mg·L-1，LOEC、EC10及EC50均>1 500 mg·L-1。

2.2.2 大型溞活動抑制效應

試驗結束時，空白對照組大型溞活動受抑制率為0%，試驗溶液的溶解氧濃度最低值為7.62 mg·L-1。滿足OECD 202試驗所有質控要求[11]。

整個試驗過程中，375 mg·L-1及以下濃度組在試驗期間未觀察到明顯的活動抑制。但24 h后，750 mg·L-14-AAA暴露組，3只大型溞出現活動抑制，1 500 mg·L-1的暴露組，抑制數量達到11只，而最高暴露組中，80%的大型溞的運動能力明顯受到抑制。暴露48 h后，抑制率明顯增加，750 mg·L-1組，運動能力受抑制的數量增加到8只，而1 500 mg·L-1和3 000 mg·L-1暴露組的抑制率分別達到70%和95%(圖1)。

圖1 不同4-乙酰氨基安替比林(4-AAA)暴露濃度下大型溞的活動抑制率Fig. 1 Mobility inhibition rate of daphnia when exposed to different concentrations of 4-acetamidoantipyrine (4-AAA)

表1 樣品的濃度分析結果Table 1 The results of samples analysis

表2 72 h內藻的生長量Table 2 Yield of alga in 72 h

濃度效應擬合曲線(圖2)分析結果表明，對大型溞(Daphniamagna)活動抑制的24 h-EC50值為1 538 mg·L-1，95%置信區間為1 217～2 017 mg·L-1；48 h-EC50值為1 041 mg·L-1，95%置信區間為834～1 304 mg·L-1。

2.2.3 魚類急性致死效應

試驗結束時，空白對照組魚無死亡現象。試驗溶液的溶解氧為79.1%～91.3% ASV。滿足OECD 203試驗所有質控要求[12]。

試驗過程中，暴露組試驗魚均未出現死亡和異常行為。試驗溶液中樣品實測濃度的幾何平均值為1 531 mg·L-1。因此，4-AAA對魚類無急性毒性，96 h-LC50為≥1 531 mg·L-1。

Zhou等[13]采用ECOSAR軟件估算其對藻和魚的急性毒性，測算得到的EC50和LC50分別為2.53 mg·L-1和6.05 mg·L-1。這可能是由于ECOSAR數據庫中與4-AAA結構類似的化合物數據較少，導致預測結果偏差較大。Gong等[14]的研究表明，其母體化合物安替比林及其催化降解產物對普通小球藻(Chorellavulgaris)在1～50 μmol·L-1范圍內沒有抑制效應。另外，催化降解過程中，隨著安替比林的降解，對豐年蝦(Artemiasalina)的致死效應降低。這表明，其降解產物毒性下降。

2.3 分類及風險評估

根據全球化學品統一分類和標簽制度(GHS)分類[15]，急性毒性終點>100 mg·L-1，無明顯急性毒性，急性毒性不歸類。根據歐盟風險評估導則，獲得3個急性毒性數據的情況下，風險評估因子為1 000[16]。選取急性毒性最大的終點值，即大型溞活動抑制的48 h-EC50為1 041 mg·L-1，由此計算4-AAA的預計無效應濃度(PNEC)為1.04 mg·L-1。其類似物4-甲基氨基-安替比林的PNEC為961 μg·L-1[17]。筆者列出了國內外地表水中4-AAA的濃度(表4)。將地表水的測試濃度除以PNEC得到風險商值(RCR)。由表4可知，我國地表水中由4-AAA引起的風險值處于較低水平。盡管歐洲污水受納河中4-AAA高達3 675 ng·L-1，其最大風險值為3.53×10-3，表明風險較低。由此判斷，水中4-AAA污染引起的生態風險較低。北京的生活污水處理廠的出水中4-AAA濃度達1 300～2 240 ng·L-1[18]。西班牙的污水處理廠出水中4-AAA更是高達25 μg·L-1[19]。Shao等[20]采用Toolox軟件計算的方法篩選基因毒性化合物，認為4-AAA具有潛在的基因毒性。同時檢測出基因毒性的地表水中也鑒別出了4-AAA。因此，盡管從現有的測試數據來看，生態風險較小，但仍需關注其對地表水的影響。因為，現有的生態毒性數據有限，評估存在較大的不確定性，后續需關注其慢性毒性。

表4 地表水中4-AAA的風險評估Table 4 Risk assessment of 4-AAA in surface water