大環內酯類抗生素對發光菌和脲酶活性影響分析

朱松梅，董玉瑛，沙志新，方政，鄒學軍

大連民族大學環境與資源學院，大連 116605

環境中很多新型有機污染物(emerging organic contaminants, EOCs)來源于醫藥品和個人護理品，EOCs在環境中的“假持久性”和對生態系統產生的不利影響逐漸被發現并引起重視[1-2]。城市中排放的大部分EOCs來自于醫院、住宅區和制造廠等不同的人類活動，這些污染物最終隨管網進入污水處理廠[3-4]。目前，污水處理廠用化學需氧量、總有機碳、總氮和總磷等傳統的綜合指標監控出水水質，這些反映污染物整體水平的指標不能針對說明個別污染物是否達到排放標準，其排入地表水中，可能會產生藥物殘留物及代謝產物，隨生物鏈傳遞，使生物被動吸收污染物并在體內不斷積累，長時間作用可能會產生一定的生物蓄積和耐藥性[5]。探究靶向明確的敏感指標有利于提出合理的應對措施。

調控污泥生化過程的穩定是利用活性污泥法處理污水的關鍵，其中，不同功能酶在各類污染物脅迫下的應激效應可直接反映活性污泥的生化性能，這與污泥系統去除污染物的能力具有相關性[6]。脲酶是一種含鎳的水解酶，與氮循環和微生物的代謝有著密切的聯系，能專一催化尿素水解為CO2和NH3，反應速率是無催化反應速率的1015倍[7]。分析EOCs對污泥脲酶活性的影響，可為提高或調控污水脫氮工藝的速率提供參考。發光菌具有快速、靈敏、操作簡單和應用范圍廣泛等優點，已有研究將發光菌用于評價排污口污水中總有機污染物毒性[8]。本研究旨在觀察幾種不同濃度大環內酯類抗生素對好氧活性污泥中脲酶活性的影響，并對比相同污染物脅迫下海洋明亮發光菌的響應，通過分析EOCs對脲酶和發光菌影響的動力學曲線，為控制EOCs對污泥活性產生不利影響的潛在風險提供基礎數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要實驗儀器

THZ-82氣浴恒溫震蕩器(江蘇金壇市金城國勝試驗儀器廠)；DHP-9082電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)；85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)；SW-CJ-1BU凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；BS214D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)。

1.2 主要試劑

紅霉素腸溶片購于西安利君制藥有限責任公司；羅紅霉素分散片購于哈藥集團制藥六廠；乙酰螺旋霉素片購于西南藥業股份有限公司；阿奇霉素分散片購于東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司。大環內酯類抗生素的成藥除有效成分外，還包含羥丙基纖維素與羧甲基淀粉鈉崩解劑、乳糖與微晶纖維素潤滑劑等輔料(也稱賦形劑)，賦形劑與主藥無配伍禁忌，不產生副作用，不影響療效，在常溫下不易變形、干裂、霉變、蟲蛀、對人體無害和無生理作用，不與主藥產生化學或物理作用。在獲得純品有難度的情況下，本研究采用經校正成藥的有效成分進行暴露實驗[9]。海洋明亮發光桿菌凍干粉購自中國科學院南京土壤研究所微生物室。活性污泥取自大連某污水處理廠。

1.3 海洋明亮發光菌的培養和毒性分析

經發光菌凍干粉劑復蘇、斜面菌種培養、搖瓶菌液培養和工作菌液制備后，進入毒性暴露實驗[10]。調配工作菌液的發光強度在300～900 mV。將待測化合物用質量分數為3%的 NaCl溶液稀釋配制為十幾個對數等間距分布的濃度，吸取不同梯度的樣品溶液2 mL于具塞磨口比色管中，以2 mL質量分數為3%的NaCl溶液作空白對照，再將0.5 mL的工作菌液加入測試管中，加塞上下振蕩均勻，去塞，精確計時，于暴露15 min時測定發光強度。每組濃度梯度做3～5個平行樣，確保毒性分析結果標準偏差低于10%。

1.4 脲酶活性的測定

脲酶活性采用苯酚鈉比色法測定[11]，以1 g烘干污泥24 h生成NH3-N的毫克數表示。脲酶活性測定的抗生素濃度0、15、30、90、120、150、180和240 μg·L-1，以1∶1的藥泥體積比進行暴露，將污泥在抗生素下的暴露時間設置為15 h。在暴露后的污泥中取5 mL污泥懸濁液和上清液分別與1 mL甲苯混合于50 mL容量瓶中，此處加入少量甲苯能夠使微生物溶解釋放出脲酶并且能夠使后續尿素水解速率大幅增加[12-13]。200 r·min-1下震蕩20 min后，加入1 mL 10%尿素溶液和4 mL檸檬酸緩沖溶液(pH=6.7)，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。取出后充分搖勻，用9 cm濾紙將混合液過濾至干凈的試管。取出3 mL濾液轉移至50 mL容量瓶中，依次加入4 mL 0.28 mol·L-1苯酚鈉和3 mL 1%次氯酸鈉。將混合液混勻靜置20 min后呈靛藍色。最后稀釋至50 mL刻線處并在578 nm下測其吸光度。

脲酶活性=(a樣品-a無污泥-a無基質)×V×n/m

式中：a樣品、a無污泥和a無基質分別為樣品、無污泥和無基質對應吸光度值按標準曲線求得的NH3-N毫克數；V為顯色液體積(mL)；n為分取倍數，浸出液體積/吸取濾液體積；m為烘干污泥的質量(g)。

1.5 實驗質量控制

通過多次測量空白組脲酶活性，對其進行誤差校正，最終確定為141.5 mg(NH3-N)·g-1。曝氣池中污泥混合液懸浮固體(MLSS)質量濃度為3 049 mg·L-1，揮發性懸浮物(VSS)約為0.7 mg·L-1，污泥容積指數(SVI)在80～120 mL·g-1。

2 結果與討論 (Results and discussion)

2.1 大環內酯類抗生素對海洋明亮發光菌的毒性作用

4種抗生素對發光菌呈現不同程度的抑制作用(圖1)，阿奇霉素、紅霉素、羅紅霉素和乙酰螺旋霉素的半最大效應濃度(EC50)分別為30.05×10-5、71.70×10-5、108.6×10-5和63.44×10-5mol·L-1，抗生素濃度和發光菌死亡率之間的可決系數(R2)經顯著性水平檢驗，置信區間范圍>90%(表1)。根據抗生素對發光強度的影響及EC50可知，4種抗生素的單一毒性大小為：阿奇霉素>乙酰螺旋霉素>紅霉素>羅紅霉素。

圖1 大環內酯類抗生素對海洋明亮發光菌的毒性作用Fig. 1 Toxicity of macrolide antibiotics to Photobacterium phosphoreum

表1 4種大環內酯類抗生素對發光菌單獨作用時的半最大效應濃度(EC50)Table 1 Concentration for 50% of maximal effect (EC50) values for Photobacterium phosphoreum when four macrolide antibiotics act alone

2.2 大環內酯類抗生素對脲酶的毒性作用

脲酶在4種大環內酯類抗生素的脅迫下表現出不同的應激反應，根據脲酶活性的變化得到4種抗生素的毒性作用強弱為：阿奇霉素>乙酰螺旋霉素>紅霉素>羅紅霉素(圖2)。其中，紅霉素、乙酰螺旋霉素和羅紅霉素脅迫下脲酶活性表現為先激活后抑制，這種現象被稱為毒物興奮效應，即在相同測量參數下，高劑量和低劑量觀察到相反的效應[14]；阿奇霉素的毒性在4種抗生素中最大，對脲酶呈現抑制效果。

圖2 大環內酯類抗生素作用下脲酶的變化注：虛線為每種抗生素對脲酶影響的擬合趨勢線。Fig. 2 Changes of urease under the action of macrolide antibioticsNote: The dotted line is the fitted trend line of the influence of each antibiotic on urease.

阿奇霉素與羅紅霉素均屬于第二代大環內酯類抗生素，二者在抗菌作用和抗菌譜間存在差異。阿奇霉素為15元氮雜大環內酯類，具有抗菌譜廣、抗菌活性強、血液和組織濃度高以及半衰期長等特點，其抗菌作用更強勁，但不良反應也更多、更嚴重；羅紅霉素為14元大環內酯類，抗菌譜和抗菌作用基本上和紅霉素相仿，僅有少部分作用對象會出現較輕的不良反應[15-16]。這與本文關于二者對發光菌和脲酶單一毒性作用的研究結果均一致。

2.3 脲酶和發光菌的毒性作用分析和環境影響評價

污染物對脲酶和發光菌的毒性作用結果一致，但隨污染物濃度增加發光菌的發光強度減弱，脲酶則呈現非單調趨勢。用發光菌的發光強度判斷污染物毒性，結果表明，污染物濃度與發光強度呈顯著負相關關系，這與方戰強等[17]的研究結果相似，污染物與發光菌之間為單向影響。對于脲酶而言，不僅污染物的含量會對其活性產生影響，且脲酶和氮循環密切相關，需要與其他微生物一起參與物質轉化和生化反應，故污染物與脲酶之間存在雙向影響[18]。活性污泥成分復雜，其中，脲酶來自不同的微生物群落，各個群落間存在一定協同和拮抗作用，不同群落之間相互影響，即它們在不同梯度暴露水平下對營養的競爭更能體現生長抑制或是協同作用[19]。這些原因導致抗生素對脲酶的毒性作用呈現波動變化。而單一的模式生物發光菌的毒性實驗中沒有復雜的生長環境，毒性作用多為單調變化趨勢。如圖2所示，添加了每種抗生素對脲酶影響的趨勢線，每種抗生素都是在某個濃度范圍出現個別異于趨勢線的波動點，根據變化率可以發現其波動范圍都比較小，包括在波動點范圍內的趨勢仍為促進作用。脲酶和發光菌都能對環境，尤其水生生態系統起到較好的指示作用。

2.4 脲酶影響脫氮過程的作用機理

近年來，二、三季度藻類水華現象頻發，氨氮含量增加是直接因素[20]。為降低水體富營養化風險和受納水體的負荷，對于氮磷的去除要求不斷提升。對比污水廠污泥馴化時微生物的存在和變化規律，隨著污泥馴化的進行，出現了2種代表污泥系統穩定運行的微生物——鐘型蟲和輪蟲，且脲酶活性不斷增加說明酶活性和生物相間有顯著正相關關系[21]。通過改變微生物的結構和種群密度能影響活性污泥分泌脲酶。污水廠生物脫氮工藝包括好氧段和缺氧段。好氧脫氮方式主要為氧化酶催化下的氧化脫氨反應和某些好氧菌在水解酶催化作用下的水解脫氮反應(式(1))，若沒有催化作用的水解反應則要消耗更多水(式(2))。在好氧條件下，硝化反應先將氨氮氧化為硝酸鹽(式(3))，再在缺氧條件下通過反硝化反應將硝酸鹽還原成氣態氮(式(4))排出完成脫氮[22]。

氨化反應方程式：

↓沒有催化作用的消去反應

(2)

硝化總反應方程式：

(3)

反硝化總反應方程式：

(4)

脲酶屬于專一水解尿素的含鎳水解酶，當污染物對脲酶活動進行干擾時，可能是由抗生素某些類似尿素的惰性結構替代了底物，進入脲酶活性中心與Ni2+發生作用，抑制了脲酶水解尿素[23]。這在一定程度上可能對氨化過程產生抑制，影響硝化和反硝化反應的效率，對脫氮工藝產生負面影響。

2.5 污水處理系統污泥穩定性和耐藥性的傳播風險

脲酶很有可能在低濃度的乙酰螺旋霉素、紅霉素和羅紅霉素的脅迫下產生了一定的耐藥性。這種情況的發生使抗生素和抗生素耐藥性決定因素通過污水處理廠排入到水生環境中，可能影響其他生物對污染物的響應，長此以往容易削弱這些藥物治療感染性疾病的能力[24]。水生生態系統的復雜性以及污染物傳播途徑的多樣性使污染物在環境中的不可控性可能比實驗的預估風險更高[4]。

抗生素耐藥性環境傳播的潛在途徑如圖3所示。環境中存在的大量抗生素會對周圍菌種產生刺激，從而引起環境中的菌株通過低于致死劑量的抗生素誘導基因產生新突變以及通過基因水平轉移而獲得耐藥性。基因轉移對抗生素抗性基因環境傳遞有很大影響，攜帶耐藥基因的DNA可以在相同或不同種屬的細菌間相互傳播，并在不同環境介質中擴散[25-27]。考慮到有些污水廠的出水可能用于二次灌溉，基于脲酶與環境間的雙向作用，若出水中脲酶過多流向土壤，容易使尿素水解過快導致氨揮發使土壤氮素損失[7]。因此，污水廠出水中對脲酶的監測同樣重要，這有助于污水處理工藝控制出水水質。

圖3 抗生素耐藥性環境傳播潛在途徑Fig. 3 Potential path of antibiotic resistance environment transmission

污染物通過污水廠的出水進行污染傳播，以脲酶和海洋明亮發光菌反映了其在生物體和環境中的發生、傳播與存在。污水處理過程中污染物對脲酶與其底物的作用進行阻斷，而污染物對發光菌的影響多是通過對其發光強度的響應進行評價。研究中4種抗生素對脲酶和發光菌的單一毒性作用基本一致，二者的不同之處主要在于：污染物對發光菌的影響是單向的，而脲酶與污染物之間存在雙向影響。研究可在一定程度上用于EOCs的環境風險評價和適當干預措施的設計，以確保水環境的良好狀態。