高效液相色譜-三重四級桿質譜法檢測藍莓中花青素

張搏贏，項 玥，張 旭，郭 霖，周蘭影

（吉林省產品質量監督檢驗院，吉林長春 130103）

藍莓，又名甸果，為杜鵑花科越桔屬多年生植物，主要產自我國東北地區。藍莓果實中富含豐富的營養物質，尤其是花青素，是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素[1]。研究表明，花青素因其具有良好的營養保健作用，還具有防止腦神經老化、抗癌、強心、軟化血管和增強人體免疫等功能，而越來越被人們喜愛[2]。

現已知的花青素有20多種，植物中重要的有6種分別為天竺葵色素、矢車菊色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽牛花色素和錦葵色素。目前，常用的花青素檢測方法有可見光分光光度法[3]、高效液相色譜法[4]及高效液相色譜-質譜聯用法[5]等。可見光分光光度法一般只能測定樣品中花青素的總量，不能測定各花青素單一含量，而且易受到其他物質的干擾，檢測結果的準確度較低；高效液相色譜法雖然能對花青素進行有效的分離，但無法對分離的花青素種類進行定性，假陽性概率大，檢測靈敏度低。綜上，本文采用高效液相色譜-三重四級桿質譜法建立同時檢測藍莓果中6種花青素的檢測方法，并給出了前處理步驟和液相色譜和質譜檢測條件，為檢測藍莓果及其他水果中花青素提供了技術方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Xevo TQS micro液相色譜-三重四級桿質譜儀（美國Waters公司）；HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州恒隆儀器有限公司）；甲醇（色譜純，美國Sigma公司）、無水乙醇（色譜純）、鹽酸（分析純）。

6種標準品：飛燕草素（花翠素）（純度≥98%）、矢車菊素（純度≥98%）、矮牽牛素（純度≥98%）、天竺葵素（純度≥98%）、芍藥素（純度≥98%）和錦葵素（純度≥98%），均購自四川省維克奇生物科技有限公司；藍莓購自超市。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1 單標儲備溶液

分別準確稱取各標準物1.00 mg到10 mL容量瓶中，用10%鹽酸甲醇溶液溶解并定容，混合均勻得到100.0 μg/mL的單標標準儲備液，貯存于棕色密閉玻璃瓶中，于-18 下保存。

1.2.2 混合標準使用液

在使用中將單一標準儲備液進行混合后，用10%鹽酸甲醇溶液作為溶劑，并逐級稀釋成0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL、150.00 ng/mL和200.00 ng/mL，混合標準使用液現用現配。

1.3 樣品前處理

稱取200 g樣品于勻漿機中勻漿，稱取樣品1.00 g于50 mL具塞刻度試管中，用提取液（體積比∶無水乙醇∶水∶鹽酸=2∶1∶1）定容至刻線，混勻1 min后，超聲提取30 min。超聲提取后，于沸水浴中水解1 h，取出冷卻后，用提取液再次定容，靜止，取上清液，用0.45 μm水相濾膜過濾，待測。

1.4 高效液相色譜-三重四級桿質譜條件

1.4.1 液相色譜條件

色 譜 柱：Phenomenex F5 100 A C18（100 mm×30 mm，2.6 μm）；色譜柱溫度：40 ；流動相：A相為1%甲酸水溶液，B相為乙腈；流速：0.4 mL/min；進樣量：1 μL。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：正離子模式掃描，掃描范圍（m/z）100～600；氮氣流量：1 000 L/h；碰撞氣（氬氣）流量：0.15 mL/min；離子源溫度：150 ；脫溶劑氣溫度：450 。6種花青素的定性定量離子對、碰撞電壓見表1。

表1 6種花青素的定性離子對、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能

2 結果與分析

2.1 檢出限、定量限及線性關系

對6個質量濃度水平的系列混合標準溶液進行測定，以各組分的提取離子峰面積（y）為縱坐標，對應的質量濃度（x，ng/mL）為橫坐標繪制標準曲線。結果發現6種花青素在一定質量濃度范圍內具有良好的線性關系，線性范圍廣，相關系數（r）為0.998 0～0.999 6，如表2所示。逐級稀釋樣品濃度，以信噪比（S/N）=3確定待測物的檢出限（LOD），S/N=10確定待測物的定量限（LOQ），得到6種花青素的LOD在0.05～0.25 ng/mL，LOQ為0.10～0.50 ng/mL，詳見表3。

表2 6種花青素的檢出限、定量限及線性關系

2.2 回收率與相對標準偏差

取藍莓樣品，向其中加入標準曲線低濃度（5 ng/mL）、中間濃度（50 ng/mL）和高濃度（150 ng/mL），按照1.3的方法處理后平行測定7次，計算不同添加水平下的回收率和相對標準偏差，如表3所示，方法回收率在99.37%～108.81%，相對標準偏差≤4.22%。此方法對6種花青素準確度好，同時具有較好的精密度，可滿足藍莓中花青素類物質的檢測。

表3 各物質的回收率和相對標準偏差（n=7）

2.3 實際樣品測定

采用本方法對超市中購買的藍莓樣品中6種花青素進行了檢測，結果如表4所示，發現樣品中錦葵素含量最多達708.201 ng/mL，天竺葵素含量最少只有0.220 ng/mL。

表4 樣品中6種花青素的含量

3 結論

建立了高效液相色譜-三重四級桿質譜法檢測藍莓中6種花青素的方法，給出了樣品前處理，色譜條件、質譜條件等，此方法操作簡單，靈敏度高，可為食品中花青素的檢測提供技術支持，為更多種類花青素的研究奠定基礎。