SIRT5對高糖環境下結腸癌細胞增殖、凋亡、遷移的影響及機制探討

賀帥，岳淑芬，周蕾，齊琦

結腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率呈逐年升高的趨勢，大多數結腸癌患者確診時已處于中晚期，預后較差［1］。糖尿病在結腸癌中常見，并影響其發展及預后［2-3］。糖代謝異常（糖代謝重編程）在結腸癌的發生、發展中發揮重要作用；而機體的代謝改變可能會驅動癌癥代謝重編程，糖尿病會加劇這種情況；有氧糖酵解對糖代謝異常具有重要意義［4-5］。Sirtuin5（SIRT5）是Sirtuins 家族中獨特的成員，其去丙二?；叭ョ牾；鹊鞍仔揎椬饔蒙婕疤墙徒膺^程中關鍵酶并可增強糖酵解，而糖酵解與腫瘤發生發展有關［6］。SIRT5 是否可通過影響糖代謝關鍵酶己糖激酶-2（HK2）及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/缺氧誘導因子（HIF）-1α/M2型丙酮酸激酶（PKM2）信號通路來促進糖代謝并參與高糖環境下結腸癌發展的研究少見。本研究利用SIRT5-RNAi 慢病毒靶向沉默人結腸癌Lovo 細胞，以檢測其對高糖環境下細胞增殖、凋亡、遷移的影響，并進一步檢測SIRT5 對糖酵解關鍵酶HK2 及mTOR/HIF-1α/PKM2 信號通路的影響，探討其與高糖環境下結腸癌發生、發展的關系及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結腸癌HT-29、SW620、SW480、Lovo細胞系購自中科院上海細胞庫；兔多克隆抗體SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2、HK2、GAPDH 及HRP-標記的羊抗兔IgG 購自北京博奧森公司；RIPA 裂解液購自上海鼎國生物技術有限公司；Trizol 購自 promega 公司；RPMI 1640 及 DMEM 培養液購自Ausbian公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Corning公司；凋亡試劑盒購自eBioscience公司；MTT購自Genview公司；BCA Protein Assay Kit 及RIPA 裂解液購自碧云天生物技術 有 限 公 司 ；PVDF 膜 購 自 millipore 公 司 ；Celigo 購 自Nexcelom公司；PCR引物由上海吉凱基因有限公司合成；MMLV 及 PCR 試劑盒購自 promega 公司；PCR 儀購自 Roche 公司；對照RNAi 慢病毒及SIRT5-RNAi 慢病毒購自上海吉凱基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與選擇、慢病毒轉染和分組 復蘇人結腸癌細胞系（SW620、Lovo、HT-29 及 SW480 細胞），置于 RPMI 1640 培養液（SW620、Lovo、SW480 細胞）及 DMEM 培養液（HT-29細胞）中（含10%FBS）培養、傳代，至細胞狀態穩定時行前期探索研究，結果顯示Lovo 細胞SIRT5 表達量最高，用此做后續實驗。分別用普通培養基（葡萄糖含量2 000 mg/L）及高糖培養基（葡萄糖含量4 500 mg/L）培養SIRT5高表達的Lovo 細胞，進行慢病毒轉染實驗，高糖培養基及普通培養基細胞各分為3 組：空白對照組（MOCK 組，無干預）、陰性對照組（NC 組，利用對照RNAi 慢病毒轉染）和SIRT5-RNAi 組（KD組，采用SIRT5-RNAi慢病毒轉染）。

1.2.2 MTT 法檢測SIRT5 瞬時沉默后Lovo 細胞增殖能力的改變 慢病毒轉染實驗分組同1.2.1；調整細胞濃度為1×104個/mL，加入96孔培養板中，每孔2 000 個細胞，每組設置3個重復；從鋪板后次日開始，培養終止前4 h每孔加20 μL MTT液（5 g/L），分別于1、2、3、4、5 d去除培養基，每孔加150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩器振蕩2～5 min，酶聯免疫檢測儀測定490 nm波長各孔光密度（OD）值，確定細胞活性，設調零孔（完全培養基+MTT+DMSO）。

1.2.3 AnnexinⅤ法檢測SIRT5 瞬時沉默后Lovo 細胞的凋亡率 慢病毒轉染分組同1.2.1，轉染后72 h 待細胞融合度為85%左右時，收集各組細胞，200 μL結合緩沖液重懸細胞，加入10 μL Annexin V-APC 染色，室溫避光10～15 min。流式細胞儀檢測凋亡情況。使用流式細胞儀分析軟件guava InCyte分析凋亡率。

1.2.4 Celigo 劃痕實驗檢測SIRT5 沉默后Lovo 細胞的遷移率 參照文獻［2］，選擇高糖環境（高糖培養基）中SIRT5 對細胞遷移能力的影響。慢病毒轉染分組同1.2.1高糖培養基分組，以50 000個細胞/孔的密度接種到96孔板中，次日細胞融合度為90%以上時用劃痕儀對96孔板輕推形成劃痕。磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗2 次，添加1%FBS 血清培養基并即刻（0 h）刷板，繼續在37 ℃，5%CO2的培養箱中培養，在24 h用Celigo 清掃平板，使用Celigo 分析遷移面積，計算遷移率=［（S3+S4）-（S1+S2）］/［1-（S1+S2）］×100%，1-（S1+S2）代表0 h劃痕區面積，（S3+S4）-（S1+S2）代表劃痕區24 h減少的面積。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測高糖環境下結腸癌Lovo細胞系SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2mRNA的表達情況 復蘇培養高糖環境下各組Lovo 細胞，分組同1.2.1高糖培養基分組，待細胞融合度達90%時，Trizol 裂解，提取總RNA，測定濃度，以1 μg RNA為模板，選取反轉錄引物，利用反轉錄酶合成cDNA，1∶100 稀釋合成的cDNA，取 1 μL cDNA組成12 μL反應體系（SYBR Premix EX taq 6.0 μL，上游引物（5 μmol/L）0.5 μL，下游引物（5 μmol/L）0.5 μL，cDNA 1.0 μL，無核酸酶水 4.0 μL），qPCR檢測高糖環境下各組Lovo細胞SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2mRNA 的相對含量，并制作熔解曲線，GAPDH為內參，引物序列見表1。反應過程：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h ，95 ℃ 15 s。采用相對定量的 2-ΔΔCt法進行數據分析。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR所用引物序列

1.2.6 Western blot 檢測高糖環境下結腸癌Lovo 細胞系SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2蛋白的表達情況 蛋白裂解液提取各組結腸癌細胞蛋白，分組同1.2.1高糖培養基分組。每個上樣孔加50 μg 蛋白，行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將蛋白轉印至PVDF 膜，5%脫脂乳封閉，4 ℃過夜，分別加入內參GAPDH 抗體及SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2、HK2 兔多克隆抗體，37 ℃溫育1 h。加HRP-標記的羊抗兔IgG（1∶5 000），37 ℃孵育1 h，化學發光試劑盒顯色，凝膠成像系統采集圖像，蛋白質條帶經Gel-Pro Analyzer version 4.5軟件進行灰度值測量，用GAPDH條帶的灰度值對測量結果進行校正。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；計數資料用例（%）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同培養條件下各組Lovo 細胞增殖情況比較 普通培養基中，SIRT5-RNAi慢病毒載體靶向沉默后1～4 d 對細胞活性無明顯影響，5 d 時KD 組較NC組、MOCK組OD值降低（P＜0.05），但后2組間差異無統計學意義；高糖培養基中，3～5 d 時KD 組較NC 組、MOCK 組 OD 值均降低，4 d 時 NC 組較 MOCK組OD值亦降低（P＜0.05），見表2。

2.2 不同培養條件下各組Lovo 細胞凋亡率的比較 普通培養基中，3組細胞凋亡率無明顯變化；高糖培養基中，KD組較NC組、MOCK組凋亡率明顯增加（P＜0.05），但后2 組間差異無統計學意義，見圖1、表3。

2.3 高糖環境下各組Lovo 細胞遷移率比較 高糖培養基中，MOCK組、NC組及KD組的細胞遷移率分別 為 55.03%±1.99%、54.13%±1.84% 及 44.18%±1.84%（F=38.792，P＜0.01），KD 組較 NC 組、MOCK組遷移率降低（P＜0.05），但后2 組間差異無統計學意義，見圖2。

2.4 高糖環境下各組Lovo 細胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2mRNA的表達水平 除NC組HIF-1α低于 MOCK 組外，NC 組、MOCK 組及 KD 組SIRT5、mTOR、PKM2及HK2mRNA 的表達水平依次降低（P＜0.01），見表4。

2.5 高糖環境下各組Lovo 細胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2蛋白的表達水平 MOCK組、NC 組及 KD 組 SIRT5、mTOR 及 HIF-1α 依次降低，KD 組較 MOCK 組、NC 組 PKM2 及 HK2 的蛋白表達水平降低（P＜0.01），但后2 組間PKM2 及HK2 的蛋白表達水平差異無統計學意義，見圖3、表5。

Tab.2 Comparison of Lovo cell proliferation ability between three groups表2 各組Lovo細胞增殖能力比較 （n=3，OD值，）

Tab.2 Comparison of Lovo cell proliferation ability between three groups表2 各組Lovo細胞增殖能力比較 （n=3，OD值，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與MOCK組比較，b與NC組比較，P＜0.05

組別MOCK組NC組KD組F普通培養基1 d 0.171±0.010 0.168±0.009 0.171±0.004 0.166 2 d 0.223±0.007 0.217±0.004 0.223±0.011 0.512 3 d 0.271±0.013 0.270±0.012 0.265±0.014 0.186 4 d 0.343±0.014 0.342±0.013 0.331±0.013 0.739 5 d 0.623±0.010 0.614±0.011 0.586±0.019ab 5.920＊組別MOCK組NC組KD組F高糖培養基1 d 0.185±0.011 0.183±0.005 0.181±0.004 0.229 2 d 0.273±0.011 0.269±0.007 0.243±0.017a 4.709＊3 d 0.351±0.012 0.345±0.009 0.251±0.006ab 111.213＊＊4 d 0.491±0.010 0.442±0.007a 0.289±0.015ab 266.024＊＊5 d 0.653±0.015 0.635±0.014 0.439±0.011ab 250.294＊＊

Fig.1 The apoptosis of Lovo cells detected by AnnexinⅤafter intervention圖1 AnnexinⅤ法檢測干預后各組Lovo細胞的凋亡率

Fig.2 The migration ability of Lovo cells after intervention detected by scratch test圖2 劃痕實驗檢測干預后各組Lovo細胞的遷移能力

Tab.3 Comparison of apoptosis rates between three Lovo cell groups表3 各組Lovo細胞凋亡率比較（%，）

＊＊P＜0.01；a與MOCK組比較，b與NC組比較，P＜0.05

組別MOCK組NC組KD組F n333普通培養基0.13±0.06 0.10±0.01 0.10±0.02 0.870高糖培養基0.63±0.06 0.50±0.10 1.43±0.06ab 137.600＊＊

Fig.3 Expressions of SIRT5,PKM2 and HK2 protein in Lovo cells圖3 各組Lovo細胞中SIRT5、PKM2及HK2蛋白的表達水平

Tab.4 Expression levels of SIRT5,mTOR,HIF-1α,PKM2 and HK2 mRNA in Lovo cells表4 各組Lovo細胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2 mRNA的表達水平 （）

Tab.4 Expression levels of SIRT5,mTOR,HIF-1α,PKM2 and HK2 mRNA in Lovo cells表4 各組Lovo細胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2 mRNA的表達水平 （）

＊＊P＜0.01；a與MOCK組比較，b 與NC組比較，P＜0.05

組別MOCK組NC組KD組F HK2 0.848±0.020 0.953±0.014a 0.556±0.022ab 384.648＊＊SIRT5 0.892±0.022 0.961±0.014a 0.315±0.023ab 955.638＊＊mTOR 0.816±0.020 0.921±0.010a 0.526±0.020ab 385.755＊＊HIF-1α 0.789±0.020 0.642±0.011a 0.319±0.027ab 466.180＊＊PKM2 0.856±0.010 0.976±0.022a 0.588±0.019ab 331.001＊＊

Tab.5 Expressions of SIRT5，mTOR，HIF-1α，PKM2 and HK2 protein in each Lovo cell group表5 各組Lovo細胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2蛋白的表達水平 （）

Tab.5 Expressions of SIRT5，mTOR，HIF-1α，PKM2 and HK2 protein in each Lovo cell group表5 各組Lovo細胞中SIRT5、mTOR、HIF-1α、PKM2及HK2蛋白的表達水平 （）

＊＊P＜0.01；a與MOCK組比較，b與NC組比較，P＜0.05

組別MOCK組NC組KD組F HK2 0.72±0.020 0.73±0.023 0.37±0.027ab 216.976＊＊SIRT5 0.730±0.019 0.690±0.022a 0.330±0.016ab 414.264＊＊mTOR 0.550±0.033 0.400±0.013a 0.250±0.012ab 150.426＊＊HIF-1α 0.390±0.034 0.220±0.021a 0.080±0.007ab 131.278＊＊PKM2 0.650±0.020 0.640±0.033 0.270±0.017ab 242.571＊＊

3 討論

研究顯示，結腸癌中伴發高血糖的總體病死率顯著高于正常血糖者［3］。SIRT5是Sirtuins家族中獨特的成員，具有NAD+依賴的去乙酰化、去丙二?；⑷ョ牾；叭ノ於；钚?，與糖脂代謝關系密切［6-7］。已有研究顯示，SIRT5 在胃癌［8］、乳腺癌［9］等惡性腫瘤細胞高表達，在腫瘤細胞的代謝重編程中發揮重要作用。本研究顯示，普通培養基中，靶向沉默 SIRT5 后 1～4 d 對細胞活性無明顯影響，5 d 時KD 組較 NC 組、MOCK 組 OD 值降低，但各組細胞凋亡率差異無統計學意義；高糖培養基中，靶向沉默后3～5 d時KD組較NC組和MOCK組OD值、24 h時遷移率明顯降低、凋亡率增加，提示與NC 組及MOCK組比較，KD組在普通培養基條件下第5天增殖才會降低，高糖培養基中沉默SIRT5 后次日細胞增殖水平即降低；高糖培養基中，KD 組較 NC 組、MOCK 組增殖、遷移能力明顯降低，而凋亡率增高，證實了SIRT5可促進高糖環境下結腸癌的進展。

HK2 及PKM2 是糖酵解過程中的關鍵酶，腫瘤細胞有氧糖酵解活躍過程中其表達水平增高［4］。PKM2翻譯后修飾可促進糖酵解，且PKM2高表達能增強Warburg 效應，促進腫瘤發生［10］。已有研究顯示，SIRT5 介導的去琥珀?；饔每烧{控糖酵解關鍵酶PKM2 的活性，進而增強糖酵解能力［10］。筆者前期研究結果顯示，SIRT5、PKM2 及HK2 在結腸癌中高表達，且高表達部位一致，三者之間有一定的相關性［11］。目前，對于SIRT5 是否可通過影響糖代謝關鍵酶HK2及PKM2表達來促進高糖環境下結腸癌發展還鮮見報道。本研究顯示，KD 組與NC 組及MOCK 組比較，高糖環境中結腸癌細胞PKM2及HK2mRNA 及其蛋白表達水平均降低，表明高糖環境下SIRT5可能通過直接或間接的方式影響糖酵解關鍵酶PKM2 及HK2 表達水平，從而促進糖酵解并參與結腸癌的發生發展。

糖代謝異常所致的高血糖環境下，HIF 通過激活葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，GLUT）及糖酵解基因的表達，可使腫瘤細胞攝入大量葡萄糖以加強糖酵解，使腫瘤細胞獲得充足的腺苷三磷酸（ATP）［12］，而活躍的糖酵解使HIF-1α 過表達，兩者共同作用促進腫瘤細胞的增殖［5］。糖酵解產生的大量乳酸可改變腫瘤細胞微環境，有利于腫瘤細胞的侵襲。mTOR信號通路PI3K/AKt/mTOR 異常與腫瘤密切相關，該信號通路改變可促進糖攝取和糖酵解的過程［13］。mTOR 與其調節的下游因子Myc家族和HIFs 家族在腫瘤中處于活化狀態且可共同作用，從而激活多種糖酵解過程中的關鍵酶，促進腫瘤的發生［14］。mTOR也可通過HIF-1α介導的PKM2基因轉錄來促進PKM2 的表達，促使腫瘤的發生，且PKM2的異常表達與多種腫瘤的轉移呈正相關已得到證實［14］。本實驗中，SIRT5-RNAi 慢病毒瞬時沉默SIRT5 后，與 NC 組及 MOCK 組比較，高糖環境中結腸癌細胞 mTOR、HIF-1α 及 PKM2 表達量均顯著下降，再次證實SIRT5 可通過直接或間接的方式影響糖酵解，促進結腸癌細胞的增殖及遷移。

綜上所述，SIRT5 可能通過促進高糖環境下糖酵解關鍵酶 HK2 表達及 mTOR/HIF-1α/PKM2 信號通路，以直接或間接方式促進糖酵解，影響結腸癌細胞增殖、凋亡及遷移，促進結腸癌的發展。因此，筆者認為SIRT5抑制劑可為結腸癌合并糖尿病的治療提供新的研究方向。