環狀RNA CDR1as與miR-7在癲癇患者血漿中的表達及與腦電圖異常的關系分析

韓永凱，李斯娜，張萍，李靜，王旭生，張帆，杜愛玲，張留莎，宋景貴△

癲癇是腦神經元突發間歇性癇樣放電引起腦部短暫功能障礙的中樞神經系統綜合征，以神經元過度、反復同步異常放電為主要特征，死亡危險性較高，是一般人群的2～3 倍［1-2］。全球約有 5 000 萬癲癇患者，其中中國癲癇患者約有600萬，每年新發癲癇患者約有40萬［3］。而經過規范治療后，通常1/3癲癇患者不能完全控制發作，嚴重影響患者的正常生活［4］。因此，探索與癲癇發病有關的生物學指標，對于臨床監測及治療癲癇有重要意義。研究發現，微小RNA（microRNA，miRNA）參與退行性神經病變及腦缺血所致神經損傷過程，在癲癇的發生中具有重要作用［5］。miR-7 是 miRNA 家族重要成員，在腦組織中表達水平較高，參與腦部炎癥以及相關疾病發生［6］。小腦變性相關蛋白1 反義轉錄物（cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as）是一種環狀RNA，可通過miR-7 途徑間接調控miR-7靶基因，影響疾病的發生發展［7］。但 CDR1as 和miR-7在癲癇中的作用尚不明確。本研究將通過檢測癲癇患者血漿中CDR1as和miR-7的表達水平，初步探討兩者與患者腦電圖異常的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016 年12 月—2019 年12 月在新鄉醫學院第二附屬醫院門診及住院的癲癇患者87例為觀察組，結合腦電圖、磁共振成像結果確診為原發性癲癇者。選取同期健康體檢者90例為對照組。收集2組性別、年齡和體質量指數（BMI）。排除標準：（1）合并其他腦組織病變，急慢性炎癥性疾病，自身免疫性疾病，心、肝或腎等重要臟器損傷，惡性腫瘤，嚴重胃腸道疾病，精神疾病，甲狀腺功能障礙及其他代謝性疾病者。（2）由腦血管意外、顱內感染等顱內病變導致的繼發性癲癇者。（3）有藥物、乙醇依賴史者。本研究經本院倫理委員會審核，符合相關倫理學規定，所有研究對象知情且簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol 試劑（貨號：QN2070-ZOG）購自北京百奧萊博科技有限公司；反轉錄試劑盒（貨號：BPI01030）購自北京華大蛋白質研發中心有限公司；實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）試劑盒（貨號：DEM202-50T）購自北京拜爾迪生物技術有限公司；白細胞介素（IL）-2、腫瘤壞死因子-α（TNF）-α、IL-1β酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號：SEKCN-0007-96Time、SEKRT-0402-96Time、SEKMY-0002-96Time）購自北京索萊寶科技有限公司；qPCR 引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。qPCR 儀（型號：QuantStudio 6 Flex）購自Life Technologies公司，酶標儀（型號：Varioskan LUX）購自Thermo Fisher公司。

1.3 血漿的檢測 清晨抽取受試者空腹外周靜脈血6 mL，4 ℃，3 000 r/min離心10 min，取血漿，分成2份。其中一份采用qRT-PCR法檢測，即按照TRIzol試劑盒說明書提取血漿中總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA質量，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 完整性，使用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，檢驗cDNA 質量。以GAPDH、U6 為內參基因。反應條件為：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環 40次。CDR1as 上游引物 5′-TAGTACGTCGTGCCCTGA-3′，下游引物5′-CACTTGACGTGCAGCATC-3′，產物大小2 116 bp；miR-7 上游引物 5′-CCACGTTGGAAGACTAGTGATTT-3′，下游引物 5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′，產物大小21 bp；內 參 GAPDH 上 游 引 物 5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，下游引物5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′，產物大小1 285 bp；內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，產物大小 207 bp。采用 2-ΔΔCt法計算血漿 CDR1as、miR-7 相對表達量。取另外一份血漿應用ELISA法檢測，具體操作均按照試劑盒說明書進行。使用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度值，繪制標準曲線，計算血漿 IL-2、TNF-α 和 IL-1β水平。

1.4 腦電圖檢查 采用腦電圖儀對癲癇患者進行檢查，按照國際10/20 系統安置電極，采用常規單極和雙極導聯描記腦電圖波形。檢查過程中，對患者進行閃光刺激及過度呼吸誘發試驗，描記時間均超過20 min。由本院腦電圖室高資歷醫生根據腦電圖作出診斷并依腦電圖結果將87 例癲癇患者分為正常組（6 例）、輕度異常組（18 例）、中度異常組（37 例）及重度異常組（26 例）。正常：α 或β 節律為主，左右對稱；輕度異常：α 節律不規則或不穩定，出現高波幅β 波，同時Q 波在各區的活動增加；中度異常：α 節律不對稱且可能消失，Q 波陣發性發作，過度換氣后高波幅δ 波成群出現；重度異常：Q 波、δ 波彌散性發作，α 波變慢甚至消失，δ 波陣發性出現，且可自發或誘發高波幅的棘波、棘慢綜合波、尖波。

1.5 統計學方法 應用SPSS 24.0進行統計分析。符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，2 組間比較行獨立樣本t檢驗；多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗；計數資料均以例（%）表示，組間比較行χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組受試者一般資料比較 5組受試者性別、年齡、BMI比較，差異無統計學意義（P＞0.05），不同程度腦電圖異常癲癇患者病程比較差異亦無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

Tab.1 Comparison of the general data between the five groups of patients表1 5組受試者一般資料比較

2.2 5 組受試者血漿CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β 水平比較 對照組、正常組、輕度異常組、中度異常組、重度異常組的血漿CDR1as、IL-2、TNF-α 和 IL-1β 水平總體呈升高變化，miR-7 水平總體呈降低變化（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the plasma levels of CDR1as,miR-7,IL-2,TNF-α and IL-1β between five groups of patients表2 5組受試者血漿CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β水平比較 （）

Tab.2 Comparison of the plasma levels of CDR1as,miR-7,IL-2,TNF-α and IL-1β between five groups of patients表2 5組受試者血漿CDR1as、miR-7、IL-2、TNF-α和IL-1β水平比較 （）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與正常組比較，c與輕度異常組比較，d與中度異常組比較，P＜0.05

組別對照組正常組輕度異常組中度異常組重度異常組F n 90 6 18 37 26 CDR1as 1.01±0.08 1.09±0.08 1.18±0.09a 1.25±0.11ab 1.33±0.13abcd 78.656＊＊miR-7 1.03±0.18 0.94±0.14 0.80±0.12a 0.61±0.09abc 0.53±0.11abcd 87.708＊＊IL-2（μg/L）146.45±27.86 175.64±11.65a 193.23±14.82a 229.86±20.86abc 246.32±16.44abc 137.916＊＊組別對照組正常組輕度異常組中度異常組重度異常組F TNF-α（μg/L）87.53±14.08 88.62±12.02 104.41±12.84a 137.08±13.65abc 144.42±14.57abc 137.321＊＊IL-1β（μg/L）47.65±13.69 63.52±8.02a 81.49±10.68ab 100.43±11.37abc 109.95±12.08abcd 193.765＊＊

2.3 癲癇患者血漿CDR1as、miR-7 水平與IL-2、TNF-α和IL-1β水平的相關性分析 相關性分析結果顯示，癲癇患者血漿CDR1as 水平與IL-2、TNF-α和 IL-1β 水平呈正相關（r分別為 0.416、0.428 和0.443，P＜0.05），miR-7 水平與 IL-2、TNF-α 和 IL-1β 水平呈負相關（r分別為-0.483、-0.455 和-0.507，P＜0.05）。

3 討論

癲癇是較為常見的神經科疾病，是由多種原因引起的慢性腦功能紊亂所致的中樞神經系統綜合征。癲癇患者腦內病灶部位的神經細胞放電異常會引起運動、感覺、意識、行為及自主神經的不同障礙，通常反復發作，但亦可自然緩解。75%～80%癲癇患者首次發作在18 歲以前，但成年人、老年人發病也不少見。流行病學調查顯示，癲癇的發病率為1%～2%［8］。然而，20%～30%患者使用一種甚至多種抗癲癇藥物治療的效果均較差，仍反復發作，影響患者身體及心理健康［9］。有研究顯示，癲癇的發生發展與炎癥反應有關，癲癇發病可激活炎癥細胞釋放炎癥細胞因子，發生全身炎癥反應，進而引起相應血清學指標的改變［10］。因此，尋找與癲癇炎癥反應發生有關的指標，闡明其分子機制，尋找新的分子治療靶點，進行有效的干預阻斷對臨床治療具有重要意義。

miRNA 是一類長度為19～25 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，通過在轉錄或轉錄后水平調控靶基因表達，參與疾病的發生發展［11］。近年來研究發現，miRNA 在腦部炎癥、癲癇的發生發展中起關鍵作用［12-13］。miR-7 在癲癇中的作用尚少見報道，但有研究表明，miR-7在腦組織中表達水平較高，在腦組織炎性損傷的發生發展中起重要作用［6，14］。環狀RNA 是一類缺乏 5′、3′末端共價結合的單鏈RNA 環狀分子，具有穩定保守、組織特異性及發育階段特異性表達等特點［15］。CDR1as 是一種與多種腫瘤及神經性疾病發生相關的環狀RNA，其可通過競爭性內源RNA 途徑阻礙miR-7 功能或發揮miR-7 的海綿作用，大量儲存 miRNA-7 并適時釋放［16］。Yang等［17］研究表明，CDR1as 可充當miR-7 海綿，將其沉默后可增強乳腺癌細胞對藥物的敏感性。另有研究表明，CDR1as在膠質瘤組織中表達水平顯著低于正常腦組織，因此其認為環狀RNA CDR1as 可能是作為抑癌基因參與調控膠質瘤的惡性生長［7］。本研究結果顯示，各組癲癇患者較健康體檢者血漿CDR1as 水平顯著升高，miR-7 水平顯著降低，且隨著患者腦電圖異常發生及腦電圖異常程度加重，血漿CDR1as 水平依次升高，miR-7 水平依次降低，提示CDR1as、miR-7 參與癲癇發生發展，并與患者腦電圖異常程度有關，但具體機制還需進一步研究。

眾多研究表明癲癇的發生發展與炎癥反應有關。Zhou等［18］研究發現，高遷移率族蛋白（HMGB）-1、IL-2和IL-6等炎癥因子參與癲癇發生發展過程。韋倩娜等［19］研究發現，TNF-α、IL-1β 參與癲癇發生，與患者腦電圖異常程度有關。本研究結果顯示，各組癲癇患者較健康體檢者血漿IL-2、TNF-α 和IL-1β 水平顯著升高，且隨腦電圖異常發生及程度加重而逐漸升高，提示IL-2、TNF-α、IL-1β 參與癲癇患者的炎癥反應過程，在癲癇發生發展中發揮重要作用，且其水平與腦電圖異常存在一定關系，與惲鴻博等［20］研究結果一致。神經系統中TNF-α 主要由膠質細胞產生的，當癲癇發作時，血腦屏障遭到破壞后，TNF-α通過血腦屏障進入腦內，同時神經元異常放電以及周圍神經膠質細胞也會促進TNF-α 的合成和分泌，參與癲癇疾病的發生；另外TNF-α 還可通過一系列級聯反應促進膠質細胞中IL-2、IL-1β等癲癇相關細胞因子表達，而這些炎癥因子又進一步通過加強神經元功能和誘導炎性反應促進癲癇疾病的發生。進一步研究顯示，癲癇患者血漿CDR1as水平與IL-2、TNF-α和IL-1β水平呈顯著正相關，miR-7水平與IL-2、TNF-α和IL-1β水平呈顯著負相關，提示CDR1as、miR-7 與IL-2、TNF-α、IL-1β 密切相關，推測CDR1as、miR-7 可能通過影響患者體內炎癥反應過程影響疾病的發生發展，但是由于目前關于CDR1as、miR-7在癲癇發生發展中作用機制的研究較少，兩者對癲癇的作用機制尚不明確，還有待進一步分析。

綜上所述，血漿CDR1as、miR-7 水平與癲癇患者腦電圖異常密切相關，分別隨著腦電圖異常發生及程度加重而升高或降低，兩者可能通過影響患者血漿IL-2、TNF-α、IL-1β 水平參與對癲癇患者腦電圖異常發生及加重的調控，但CDR1as、miR-7 在癲癇中的具體作用機制還需擴大樣本量進行深入研究。