呼吸道病毒、炎癥細胞因子、肺功能在慢性阻塞性肺疾病急性加重期的診斷價值及其相關性

孟偉峰 朱 衍 童偉隆 趙桂琴

相關研究報道，慢性阻塞性肺疾病的主要病理改變是氣道炎癥，且炎性反應與肺功能具有相關性[1-2]。但炎性因子的異常變化在其他疾病中亦會發生，故不能作為評價肺功能損傷程度的最佳指標。臨床研究提示，呼吸道病毒感染是慢性阻塞性肺疾病急性加重的主要原因，在該病的發生發展過程中發揮重要作用[3-4]。病毒感染可誘導機體發生炎癥反應，而臨床關于呼吸道病毒感染與炎癥因子在慢性阻塞性肺疾病中的相關報道甚少，且缺乏關于呼吸道病毒感染與肺功能的研究。基于此，本研究將探討呼吸道病毒、炎癥細胞因子、肺功能在慢性阻塞性肺疾病急性加重期的診斷價值及其相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以2017 年11 月—2019 年11 月于浙江省紹興市第七人民醫院收治入院的慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者102 例為研究對象。其中男78 例，女24 例，年齡46～69（56.83±8.21）歲。本研究方案的制定符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》的相關要求，且已通過我院倫理委員會審核。

1.2 納入及排除標準 納入標準：（1）均符合2013年《慢性阻塞性肺病診治指南（修訂版）》[5]中的相關標準；（2）無哮喘病史、過敏性鼻炎及支氣管擴張者；（3）所有患者及其家屬均自愿參與研究并簽署知情同意書；（4）近8 周內無服抗病毒藥物者；（5）近8 周內無COPD 急性發作及病毒感染病史；（6）臨床資料完整者；（7）精神正常且依從性較好者。排除標準：（1）合并肝腎功能障礙；（2）合并肺栓塞、活動性肺結核等其他疾病；（3）合并其他惡性腫瘤者；（4）不能配合完成研究；（5）長期使用全身性糖皮質激素。

1.3 方 法 （1）標本采集：痰液標本在患者入院24h 內留取。采樣前囑咐患者保持平靜，無痰的患者給予霧化吸入3%氯化鈉溶液10min 后留痰；有痰的患者給予生理鹽水漱口，將深咳吐出的痰存放在無菌痰杯中。采用生理鹽水將痰液洗滌后通過低倍鏡篩查，鱗狀上皮細胞＜10 個/視野，白細胞＞25 個/視野，或同個視野下鱗狀上皮細胞/白細胞＜2.5，為合格，不合格者需再次留取。將痰液標本放置于4℃冰箱，在48h 內進行檢測。（2）肺功能檢測：患者入院24h 后，均采用肺功能檢測儀（日本，福田，ST320）對患者1s 用力呼氣容積（FEV1）與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）、FEV1 占預計值百分比（FEV1%）進行測定。（3）提取病毒核酸：采用體液病毒DNA/RNA 小量試劑盒（美國AXYGEN 公司，批號AP-MN-BFVNA-50）進行檢驗。（4）病毒檢測：采用呼吸道病原體多重熒光PCR 檢測試劑盒（美國Roche 公司，批號53-0101-96），采用熒光PCR 擴增儀（美國，羅氏公司，LightCycler 480Ⅱ型），對11 種病毒進行檢測包括流感病毒（InfA、InfB 型）、冠狀病毒（OC43、HKU1、229E 型）、人博卡病毒（HBoV）、腸道病毒（HEV）、人鼻病毒（HRV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人偏肺病毒（HMPV）及腺病毒（ADV）等。熒光PCR擴增儀檢測病毒陽性后，再選用相應病毒引物僅行PCR 擴增。本研究中所述呼吸道病毒序列、靶點及片段長度（見表1）。RT-PCR 擴增：按DNase/RNase Free H2O 8μL+5x RT Buffer 4μL+RT primer mix 2μL+Reverse transcriptase1μL+Sample 5μL 的比例共20μL，在PCR 管內加入試劑和樣品以進行目的片段反轉錄，混勻后按48℃1min、42℃60min、95℃5min 溫度孵育，4℃保存；按10×PCR Buffer 2μL+25mmol/L MgCl24μL+PCR primer mix 2μL+Solution X 2μL+TaqDNA Polymerase 0.7μL+RT 產物9.3μL 的比例共20μL，在另一PCR 管內加入試劑和樣品以進行目的片段的PCR，混勻后按94℃1min、94℃ 30min、60℃ 30min、70℃ 1min 進行熱循環反應，重復35 次，70℃1min，4℃保存。根據病毒檢驗結果陽性或陰性將其分為陽性組與陰性組。（5）炎癥細胞因子測定：抽取所有患者清晨空腹時靜脈血3～5mL，以2500r/min 離心15min，收集上清置于-30℃冰箱保存，用于檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、調節活化正常T 細胞表達和趨化因子（RANTES）、干擾素誘導蛋白（IP-10）、干擾素-γ（INF-γ）、可溶性白細胞介素-2 受體（sIL-2R）、IL-8、IL-6 水平。均采用定量酶聯檢測法進行檢測（海森雄科技實業有限公司），需嚴格按照說明書進行操作。

1.4 統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件分析所有數據，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，偏態分布定量資料采用M（P25，P75）進行描述，兩組間樣本均數比較采用t 檢驗表示；多組樣本均數間比較采用方差分析，組間兩兩比較用LSD 法表示，計數資料采用χ2檢驗表示；采用Spearman 相關性分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病毒檢測結果 102 例患者共39 例經病毒檢測為陽性，陽性率為38.24%（39/102）。其中最為常見的病毒為A 型流感病毒共15 例，陽性率為38.46%（15/39），以9 月—次年1 月為高發期；其次為鼻病毒共11 例，陽性率為28.21%（11/39），以7—11 月為高發；再次為人偏肺病毒5 例，陽性率為12.82%（5/39），以12 月—次年1 月為高發；副流感病毒3 型2例，陽性率為5.13%（2/39），在5 月與10 月發現；呼吸道合胞病毒2 例，在11 月與12 月發現；冠狀病毒OC43 型1 例，在4 月發現；腸道病毒1 例，在11 月發現；腺病毒1 例，在3 月發現。其中發生同時感染鼻病毒伴博卡病毒和鼻病毒伴流感病毒A 型患者2例，分別發生在4 月與3 月。

2.2 一般情況比較 兩組患者年齡、性別、吸煙、體質指數、使用ICS、高血壓、冠心病、心律失常、mMRC評分、WBC、NEUT、EOSC、ALT、SCr、CD4+比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；兩組住院時間、糖尿病、肺功能指標（FEV1/FVC、FEV1%）、發熱、CAT 評分及CD8+比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 呼吸道病毒序列、靶點及片段長度[6-7]

2.3 炎性細胞因子比較 病毒陽性組患者血清IL-6、IL-8、IP-10、RANTES、sIL-2R、INF-γ、TNF-α 及CRP 水平均高于病毒陰性組，但兩組INF-γ 相比，差異無統計學意義（P＞0.05），其他差異有統計學意義（P 均＜0.05）。見表3。

2.4 相關性分析 FEV1%、FEV1/FVC、糖尿病、發熱、CAT 評分、CD4+、IP-10、sIL-2R、TNF-α 水平與病毒陽性呈負相關（r=-0.452、-0.552、-12.987、-0.672、-0.563、-0.872、-0.982、-0.972、-7.372，P 均＜0.001）。

3 討論

慢性阻塞性肺疾病是呼吸科常見的一種慢性炎癥性疾病，受呼吸道感染的影響會加重病情，常見的病原體為病毒[8]。由于呼吸道病毒的分布與季節性呈正相關，本研究為減少季節性分布造成的偏倚，設置研究時間為2 年。本研究結果顯示，慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者病毒檢測陽性率為38.24%，其中最為常見的是流感病毒A 型，其次為鼻病毒。本研究結果與杜小兵等[9]及趙春柳等[10]研究相似。穩定期的慢性阻塞性肺疾病患者可檢出病毒；而急性加重期患者痰液經檢測可觀察到病毒核酸，且伴嚴重的氣促、咳嗽、咳痰及發熱等癥狀。本研究結果顯示，病毒陰性組的住院時間、糖尿病、肺功能指標（FEV1/FVC、FEV1%）、發熱、CAT 評分及CD8+均優于病毒陽性組（P＜0.05），提示糖尿病、發熱、穩定期CAT 評分可增加病毒感染風險，而肺功能指標（FEV1/FVC、FEV1%）降低、CD8+細胞比例下降，延長住院時間，則易導致穩定期慢性阻塞性肺疾病患者感染病毒，加重病情，不利于康復。

表2 兩組慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者一般資料比較

表3 兩組慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清炎性細胞因子比較（）

表3 兩組慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清炎性細胞因子比較（）

注：IL-6 為白介素-6；IL-8 為白介素-8；IP-10 為干擾素誘導蛋白；RANTES 為趨化因子；sIL-2R 為可溶性白細胞介素-2 受體；INF-γ 為干擾素-γ；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；CRP 為C 反應蛋白

Kido 等[11]通過研究證實，慢性阻塞性肺疾病患者肺部產生的炎癥可轉移至血液且可隨血液在體內循環，形成系統性炎癥反應。炎癥反應中的重要組成部分為細胞因子，各個細胞因子在免疫系統中發揮不同的作用，在慢性阻塞性肺疾病急性加重期以急性呼吸道病毒感染為主。在炎癥因子中IL-6 屬于白細胞介素的一種，由巨噬細胞產生，參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能[12]；IL-8 是趨化因子家族的一種細胞因子，參與和調節機體內生殖生理和病理過程[13]；IP-10 是CXC 趨化因子家族的一員，可與相應的CXCR3 受體相互作用，參與抗病毒、活化吞噬細胞等作用[14]。sIL-2R 是一種復合性粘蛋白，可仰制已活化的T 細胞的克隆化擴增[15]。TNF-α 由單核-巨噬細胞產生，具有廣泛的生物活性，可促使炎癥細胞黏附，從而導致大量的活性氧自由基產生，對機體造成氧化損傷，并可釋放IL-6 及IL-8 等炎性因子，增加機體的炎癥反應[16]。本研究結果顯示，病毒陽性組的IL-6、IL-8、IP-10、RANTES、sIL-2R、TNFα 及CRP 均高于病毒陰性組，提示慢性阻塞性肺疾病急性加重期在呼吸道病毒感染后系統性炎癥水平明顯升高。

Sithisarn 等[17]研究提示，IP-10 水平與所感染病毒量具有一定的相關性；Ng 等[18]研究則證實，IP-10水平越高則患者病毒感染后的病情越嚴重。由于病毒感染初期的臨床癥狀并不明顯，患者就診不及時，且病毒陽性組血清IP-10 水平明顯高于病毒陰性組，故病毒陽性導致的病情更嚴重。由于本研究未對病毒定量檢測，故無法深入分析病毒載量高低的問題。另一方面本研究中sIL-2R 升高，這可能是由于病毒感染后導致淋巴細胞的活化造成的。本研究相關性分析結果顯示，FEV1、FEV1/FVC、糖尿病、發熱、CAT 評分、血清CD4+、IP-10、sIL-2R、TNF-α 水平與病毒陽性呈負相關，提示呼吸道病毒及炎癥細胞因子會導致肺功能下降，從而影響慢性阻塞性肺疾病急性加重期的病情，且三者之間具有一定的相關性。

總而言之，呼吸道病毒、炎癥細胞因子、肺功能在慢性阻塞性肺疾病急性加重期均具有一定的診斷價值，且三者之間具有一定的相關性。