結核RNA檢測在肺結核中的早期診斷價值

李成行 李月翠 張莉莉

結核病的早期發現對于結核防控至關重要，然而部分患者臨床表現及影像學表現不典型，診斷困難[1-2]。涂片及培養是肺結核傳統的病原學檢測方法，但陽性率均偏低，培養還存在時間過長的缺點[3]。結核RNA 檢測的技術原理是以16S rRNA 為靶標，通過恒溫RNA 擴增檢測技術（SAT），快速準確地判斷待檢樣本中是否有結核分枝桿菌的存在。結核RNA檢測不僅擴增效率更高（30min 內擴增10 億倍）、反應更穩定，還能夠區分死菌活菌。且由于RNA 在環境中更容易降解，因此實驗室污染更少[4-5]。本研究擬采用結核RNA 檢測技術（TB SAT），對疑似結核病患者的痰液或支氣管肺泡灌洗液標本進行測定，并對其結果進行分析比較，評估其臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年1 月—2017 年6 月浙江省永康市第一人民醫院收治的272 例肺部影像學異常的疑似結核患者，男151 例，女121 例。研究經醫院倫理委員會審核通過，符合《赫爾辛基宣言》倫理原則，所有入組患者均簽署知情同意書。

1.2 診斷標準[6]（1）肺結核確診標準：影像學具有疑似肺結核表現、涂片陽性，或分枝桿菌分離培養陽性，或肺組織病理學檢查陽性的患者。（2）臨床診斷肺結核的判斷標準：胸部影像學顯示與活動性肺結核相符的病變，具有咳嗽、咯痰、咯血等癥狀，免疫學檢查陽性，經過診斷性抗結核治療隨訪病灶好轉或經鑒別診斷排除其他肺部疾病者。（3）非肺結核患者的判斷標準：指診斷為肺結核以外的其他肺部疾病，且經過非結核病治療好轉者。

1.3 納入及排除標準 納入標準：（1）患者存在明顯的咳嗽、咳痰等臨床變現；（2）符合活動性肺結核病變的胸部X 片表現。排除標準：既往有結核病的患者，不能耐受氣管鏡檢查者。

1.4 儀器與試劑 TB SAT 采用的Mag-X 全自動核酸提取儀由中國嘉興凱實生物科技有限公司提供、所用ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀由美國ABI 公司提供、所用300W 水浴超聲儀和RNA 恒溫擴增試劑盒由中國上海仁度生物科技有限公司提供（批號20160201、20160501）；抗酸桿菌涂片染色液由珠海貝索生物技術有限公司提供（批號C150901）；全自動分枝桿菌培養鑒定藥敏系統BACTEC MGIT 960 及其配套試劑均由美國BD 公司提供（批號20160301）。

1.5 方 法 留取所有研究對象1 份晨痰或肺泡灌洗液（BALF）樣本。BALF 視清濁度不同，對于帶有黏液的BALF 標本可適量加入一些4%NaOH 溶液進行液化，最多不超過樣本量的1 倍體積。

涂片檢查：遵照《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[7]中的標準化操作程序執行。培養檢查：吸取2mL 待檢標本至50mL 離心管中，嚴格按照BACTEC MGIT 960 系統操作說明書進行操作，培養時間設定為42 天。儀器報告陽性后，取培養液進行涂片鏡檢，若查到抗酸桿菌則為陽性；若未見抗酸桿菌則為陰性。

TB SAT 檢測：將待檢標本用13000r/min 離心5min，棄上清液，加入50μL 裂解緩沖液，重懸后放入超聲清洗器中超聲處理15min，超聲功率為300W。陽性對照和陰性對照與待檢標本同步進行。超聲結束后，取2μL 處理物加入預先混合好的30μL 擴增檢測液中。再將反應管置于干熱恒溫器上60℃保溫1min后，再置于42℃保溫5min，同時將酶液預熱至42℃。預熱后，向每支反應管中加入10μL 酶液，混勻后將反應管快速轉至7500 型實時熒光定量PCR 儀中啟動反應程序。反應程序為熒光通道設定為FAM，每個循環為42℃、1min，共40 個循環。

1.6 統計學方法 采用SPSS 18.0 軟件進行數據分析，定量資料以均數±標準差（） 表示，正態性檢測采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗；正態分布數據組間比較采用t 檢驗，非正態分布數據組間比較采用Wilcoxon 檢驗；率的比較采用卡方檢驗；P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較 272 例患者中，培養陽性肺結核患者85 例，培養陰性經過臨床診斷肺結核患者95例，年齡（36.17±13.15）歲；非結核患者92 例，年齡（43.25±15.33）歲，其中肺炎68 例（73.91%）、支氣管擴張7 例（7.61%）、肺癌7 例（7.61%）、真菌感染7 例（7.61%）、非結核分枝桿菌肺病3 例（3.26%）。

2.2 涂片、培養及TB SAT 檢測結核分枝桿菌的效能評價 以臨床診斷結果為金標準[6]，確認活動性肺結核病180 例，非結核病患者92 例。涂片、培養、TB SAT 檢測結核分枝桿菌的靈敏度分別為26.11%、47.22%及59.44%。TB SAT 的檢測靈敏度明顯高于涂片（χ2=40.852，P＜0.01）和培養（χ2=5.402，P＜0.05），差異有統計學意義。見表1。

2.3 TB SAT 檢測診斷涂陰肺結核的效能 以臨床診斷結果為金標準[6]，133 例涂陰肺結核患者：培陽41 例，培陰92 例；TB SAT 陽性60 例（涂陰培陽肺結核患者陽性37 例，涂陰培陰肺結核患者陽性23例），TB SAT 陰性73 例；92 例非結核患者：TB SAT陽性1 例，陰性91 例。TB SAT 診斷涂陰肺結核的靈敏度為45.11%（60/133），特異度為98.91%（91/92），陽性預測值為98.36%（60/61），陰性預測值為55.49%（91/164）。見表2。

2.4 療效評估 TB SAT 檢測陽性患者治療3、6 個月后，TB SAT 陽性率分別為66.67%（30/45）及21.74%（5/23），陽性率明顯下降，差異有統計學意義（P 均＜0.05）。

3 討論

對早期結核患者進行快速準確診斷是目前結核防控的難點，目前已有的常規檢測很難滿足臨床的需求[8-9]。本研究采用的結核RNA 檢測（TB SAT）技術原理是以16S rRNA 為靶標，通過恒溫RNA 擴增檢測技術（SAT），快速準確地判斷待檢樣本中是否有結核分枝桿菌的存在[10]，還能夠區分死菌活菌，因此這種方法可有效輔助診斷肺結核病、以及評估抗結核治療療效[11]。

本研究采用疑似肺結核患者的BALF 標本，比較涂片鏡檢、培養、TB SAT 方法的診斷性能。本研究發現，TB SAT 的靈敏度明顯優于培養以及涂片法，而特異度與培養以及涂片法相當；提示TB SAT 檢測具有高靈敏度高特異度的優勢，能更好的幫助臨床醫生進行早期診斷和治療。進一步的分析發現，TB SAT檢測在涂陽培陽患者中的靈敏度及特異度高達100%、在涂陰培陽患者中的靈敏度高達90.24%、在涂陰培陰患者的靈敏度為25.00%。這表明TB SAT檢測在涂片陽性患者或培養陽性患者中，均表現出了優異的檢測性能；由于TB SAT 還可進一步提升在涂陰培陰患者中的檢出率，提示其臨床應用價值與培養相當甚至可能略高，可更好的輔助臨床醫生對涂陰或菌陰患者進行早期診斷和治療[3，12-13]。

表1 涂片、培養及TB SAT 檢測結核分枝桿菌的效能

表2 TB SAT 在涂陰肺結核中的診斷價值[%（例）]

總的來說，TB SAT 具備快速、簡便、靈敏度高、特異度高的特點，診斷性能與液體培養相當甚至可能略高，還可輔助療效評估，在結核病診療上具有重要的臨床應用價值。