膀胱尿路上皮癌組織中SRSF1及Caspase-3的表達水平及臨床意義

宰國真，王旭東，馬梅，李彥偉

(鄭州大學第五附屬醫院 病理科， 河南 鄭州 450052)

選擇性剪接為保持真核生物蛋白質功能多樣性的重要途徑，其在腫瘤的發生、發展中起重要作用[1]。絲氨酸/精氨酸富有剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1，SRSF1)為代表性選擇性剪接因子，相關研究證實，其在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞中存在過表達現象[2]。有研究指出，SRSF1可影響天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(cysteinecontaining aspartate specific proteinase，Caspase)、抗凋亡基因(Bcl-X)激活的DNA酶抑制蛋白的剪接，對腫瘤細胞的凋亡、生長起調控作用[3]。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinecontaining aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)為重要細胞凋亡效應分子，可參與多種因素引起的細胞凋亡，其水平降低，可引起腫瘤細胞過度增殖。本研究探討膀胱浸潤性尿路上皮癌組織中SRSF1、Caspase-3的表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年3月至2019年6月鄭州大學第五附屬醫院收治的92個膀胱浸潤性尿路上皮癌手術或活檢標本為觀察組，選取同期20個病理檢查結果為正常膀胱尿路上皮組織的活檢標本為對照組。對照組：男12例，女8例；年齡34～78歲，平均(51.26±8.52)歲。觀察組：男56例，女36例；年齡35～76歲，平均(50.29±6.34)歲；腫瘤分級為53例高級別，39例低級別。所有病理切片由3名資深病理醫生根據WHO(2004)泌尿系統和男性生殖器官腫瘤分類標準進行復診。標本經100 g·L-1的中性緩沖福爾馬林固定、石蠟包埋，做成厚4 μm的石蠟切片。兩組性別、年齡、腫瘤分級比較，差異無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經鄭州大學第五附屬醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 免疫組織化學檢測采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶方法(streptavidin peroxidase，SP)，按照免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)說明操作。兔抗人SRSF1多克隆抗體、兔抗人Caspase-3多克隆抗體均購自北京中山生物技術公司。采用梯度酒精、二甲苯對切片進行脫蠟水化，采用體積分數為3%的過氧化氫室溫處理10 min，進行微波抗原修復，加入正常山羊血清室溫孵育15 min，滴加稀釋濃度為1∶200的一抗，在4 ℃保濕盒內孵育過夜。用磷酸緩沖鹽溶液沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，室溫孵育10 min，滴加鏈親和素顯色10 min。采用蘇木精復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。以磷酸緩沖鹽溶液作陰性對照。

1.3 判斷標準參考說明書觀察SRSF1和Caspase-3蛋白的陽性表達情況，SRSF1主要定位于細胞核，Caspase-3主要定位于細胞質，細胞核或細胞質呈棕黃(褐)色判讀為陽性。在高倍鏡下進行細胞計數。染色強度打分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無色為0分，并于背景著色對比。陽性細胞占比打分：陽性細胞>75%為4分，51%～75%為3分，11%～50%為2分，1%～10%為1分，陰性為0分。陽性細胞百分比乘以染色強度≥3分為陽性(+)。

1.4 觀察指標(1)SRSF1表達及臨床意義。(2)Caspase-3表達及臨床意義。(3)SRSF1與Caspase-3表達相關性。

1.5 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件處理數據。SRSF1、Caspase-3表達以頻數和率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Spearman對SRSF1、Caspase-3表達進行相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SRSF1表達觀察組SRSF1陽性表達率[84.78%(78/92)]高于對照組[10.00%(2/20)]，差異有統計學意義(P<0.001)。觀察組中單發與多發、低級別與高級別、轉移與無轉移及不同臨床分期SRSF1陽性表達率比較，差異無統計學意義(均P>0.05)；復發性膀胱浸潤性尿路上皮癌組織中SRSF1陽性表達率高于原發性癌，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 觀察組SRSF1表達及臨床意義[n(%)]

2.2 Caspase-3表達觀察組Caspase-3陽性表達率[30.43%(28/92)]低于正常組[90.00%(18/20)]，差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組中單發與多發、原發與復發、低級別與高級別、轉移與無轉移及不同臨床分期Caspase-3陽性表達率比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 觀察組Caspase-3表達及臨床意義[n(%)]

2.3 SRSF1與Caspase-3表達相關性觀察組78例SRSF1陽性表達中60例Caspase-3呈陰性表達，發生率為76.92%(60/78)，14例SRSF1陰性表達中10例Caspase-3呈陽性表達，發生率為71.43%(10/14)，兩種蛋白表達均為陽性18例，均為陰性4例。以Spearman進行相關性分析，觀察組Caspase-3與SRSF1的表達呈負相關(r=-0.369，P<0.05)。

3 討論

膀胱癌為常見泌尿外科惡性腫瘤，近年來，其發病率、病死率呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康，且其發病機制尚未明確[4]。選擇性剪接在腫瘤的發生、發展中起重要作用，SRSF1與腫瘤直接相關，相關研究證實，SRSF1調控可變剪接事件可促進腫瘤發生，同時可調控細胞侵襲、運動，與惡性腫瘤特點相同[5]。研究顯示，SRSF1還通過調控Bcl-X和Caspase激活的DNA酶抑制蛋白的剪接對乳腺癌細胞生長及凋亡產生影響[6]。此外，肺癌中SRSF1可與抗凋亡蛋白Survivin mRNA結合，增強其穩定性，并促進其翻譯，使其表達增加，同時抑制Caspase蛋白，抑制肺癌細胞凋亡[7]。細胞中Caspase蛋白家族通常以酶原(無活性)形式存在，但Caspase可自我活化、相互激活，呈級聯放大效應參與凋亡過程，其中Caspase-3尤其重要，可破壞細胞核纖層，破壞細胞結構，參與多種因素引起的細胞凋亡[8]。

本研究以免疫組化法檢測SRSF1、Caspase-3在膀胱浸潤性尿路上皮癌與正常膀胱黏膜組織中的表達情況，結果顯示，對照組SRSF1陽性表達率低于觀察組，復發性膀胱浸潤性尿路上皮癌中SRSF1陽性表達率高于原發性癌。這表明在膀胱浸潤性尿路上皮癌中SRSF1高表達與腫瘤復發密切相關。觀察組Caspase-3陽性表達率高于對照組，提示Caspase-3可能與腫瘤耐凋亡特征有關。研究發現，膀胱癌組織中Caspase-3低表達，且與膀胱癌復發密切相關[9]。本研究中Caspase-3蛋白表達降低與腫瘤復發、轉移、病理分級、臨床分期無相關性，有待進一步驗證。此外，本研究相關性分析顯示，觀察組Caspase-3與SRSF1的表達呈負相關，提示SRSF1有抑制Caspase-3的作用，兩者呈反向平衡。Caspase-3、SRSF1共同調節膀胱尿路上皮癌細胞凋亡，與其發生發展關系密切。

綜上可知，SRSF1可能通過增加抗凋亡蛋白對Caspase-3起抑制作用，以抑制膀胱尿路上皮癌細胞凋亡。同時，SRSF1與膀胱浸潤性尿路上皮癌的發生、發展及復發關系密切，膀胱浸潤性尿路上皮癌組織中SRSF1高表達與Caspase-3低表達對膀胱尿路上皮癌患者病情進展起促進作用。