氣滯血瘀型非小細胞肺癌患者腸道菌群-免疫功能的初步研究*

錢 祥 陳 卓 張愛琴#

1 中國科學院大學附屬腫瘤醫院 浙江 杭州 310022

2 中國科學院腫瘤與基礎醫學研究所 浙江 杭州 310022

3 浙江省腫瘤醫院 浙江 杭州 310022

本文研究氣滯血瘀型非小細胞肺癌腸道菌群與免疫功能的差異，旨在為充實中醫理論的現代化研究供應新方法，這也將是疾病診斷和健康評估理念的新起點。

1 臨床資料

1.1 研究對象：研究對象為2019年3月1日至2019年10月30日在中國科學院大學附屬腫瘤醫院胸部外科收治的經手術病理和/或穿刺活檢術證實為非小細胞肺癌且符合本研究組納入標準的患者，另設健康人群作為空白對照組。嚴格根據如下標準，最終納入氣血瘀滯組13例，健康對照組12例。

1.2 納入標準：分述如下。

1.2.1 患者入組標準：年齡18～70周歲；參照中國臨床腫瘤學會（CSCO）非小細胞肺癌診療指南（2018年版），經手術病理和/或穿刺活檢術證實為非小細胞肺癌的患者；非其他部位腫瘤轉移至肺部；中醫辨證分型參照全國高等中醫藥院校規劃教材（9版）《中醫診斷學》及相關文獻，辨證結果符合氣血瘀滯證；患者本人及家屬同意參與本項研究，并簽署相關知情同意書。

1.2.2 正常人群入組標準：空白對照組為正常健康志愿者，年齡18～70周歲，無合并嚴重心腦血管類的病史；近期三大常規、生化指標、腫瘤標志物、心電圖、超聲、胸部X片等均正常；近期未使用任何抗生素、腸道菌群調節劑等藥物；無吸煙史、酗酒史等不良嗜好；舌質淡紅、舌苔薄白，脈象和緩有力。

1.3 排除標準：近5年內曾患有或合并其他惡性腫瘤，但已充分治療并控制的扁平細胞癌、子宮頸的原位癌或皮膚基底細胞癌除外；合并腦血管疾病、心臟病、肝腎相關疾病等重大內科疾病者，或目前正在參與其他臨床實驗的患者；近1月內有使用抗生素、腸道菌群調節劑等藥物的患者；患有癡呆、精神異常、智力低下等任何妨礙對知情同意書理解的患者；不符合氣滯血瘀型中醫證候辨證分型標準的患者。

1.4 退出標準：依從性差；患者自己要求終止試驗；患者不依從臨床研究的相關程序；中醫證型發生改變。

1.5 中醫辨證：氣滯血瘀證辨證參照全國高等中醫藥院校規劃教材（9版）《中醫診斷學》及相關文獻：咳嗽不暢，痛處固定，夜間加劇，拒按，面色紫黯，舌質紫黯、邊尖有瘀斑，脈細澀或結代。

2 檢測方法

2.1 試劑與儀器：生化培養箱（LRH-150），酶標儀（CMaxPlus），白介素-12（IL-12）試劑盒（MM-2449H1），γ-干擾素（IFN-γ）試劑盒（MM-0033H1），MiSeq Reagent Kit PE300 v3，Roche Light Cycler96，XiangYi H1650-W離心機，Vortex，NanpDrop，Invitrogen Qubit Spectrophotometer，MiSeq Benchtop Sequencer，DNA電泳槽，凝膠成像系統，磁力架，瓊脂糖（電泳），TAE（電泳），Aglient SureCycler 8800 Thermal Cycler，80%乙醇（純化），Miseq 2×300v3試劑盒，羅氏LightCycler 96 qPCR儀 ，KaPA library Quantification Kit，含Qiime分析軟件的計算機。

2.2 檢測方法：分述如下。

2.2.1 免疫相關因子檢測：使用EDTA抗凝真空采血管收集符合本研究組所設標準的患者空腹外周血5ml，靜置半小時后采用3000r/min離心分離血清，從冰箱中取出血清，室溫復溫平衡20min，用酶聯免疫吸附法（PCR）檢測血清中IL-12、IFN-γ的含量。①標準品和待測樣本：將一定數目的酶標包被板置于框架上，分別設置空白對照孔、待測樣本孔、標準品孔，并且記錄下三組孔位置，將50μl標準品加入標準品孔中；將10μl待測樣本加入待測樣本孔中，然后再加入40μl樣本稀釋液；空白對照孔不加。②將100μl辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體分別加入待測樣本孔和標準品孔中，空白對照孔不加。③溫育：反應孔用封板膜封住，在37℃的恒溫箱中溫育1h。④洗板：除去液體，并在吸水紙上吸干，將洗滌液填滿每個孔，靜置1min后將洗滌液除去，繼續用吸水紙拍干，上述步驟重復5遍。⑤顯色：每孔先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，用平板混勻器混勻30s，37℃避光顯色15min。⑥終止：拿出酶標板，將50μl終止液加入到每個孔中，終止反應。⑦測定：以空白對照孔調零，在終止反應后的15min內，用450nm的波長測量出各孔的吸光值。

2.2.2 腸道菌群檢測：①糞便采集及DNA提?。号c患者及正常健康志愿者充分溝通后，簽署知情同意書。采集受試者自然排出至無菌容器內的新鮮糞便，迅速將糞便置于取樣試管中，并1h內運至實驗室進行樣品前處理。稱取200mg糞便樣本，然后加入30ml緩沖溶液，置于震蕩器上充分震蕩混勻，高速離心機以1000rpm離心5min后收集沉淀。重復上述操作3次后沉淀以10ml緩沖液重懸，將重懸液按每管1ml分裝后放置在－80℃度冰箱中。糞便微生物DNA使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit依照使用說明進行提取。待提取后，用瓊脂糖凝膠電泳和Thermo Nano Drop 2000紫外微量分光光度計進行總DNA質檢。②目標區域擴增：將樣本進行16S V3-V4區域擴增，引物信息為：Forward primer：CCTACGGGNGGCWGCAG； Reverse primer：GACTACHVGGGTATCTAATCC。將稀釋后的基因組DNA作為模板，使用Phanta Max Master Mix（Vazyme）高保真酶進行PCR，以保證擴增的準確和高效。PCR的反應條件是：95℃預變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，重復25個循環；最后72℃持續5min。PCR反應體系為：2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）25μl，引物（10μM）各為2μl，加入ddH2O至50μl。③產物質檢：取1.5μlPCR產物（上一步驟所獲取的），使用2%瓊脂糖膠，置于120V電壓下持續電泳20min后使用凝膠成像系統進行紫外成像拍照。④上機測序及生信分析：文庫質檢合格后，使用Qubit對混合文庫pool進行濃度定量，并依據每個樣品的數據量要求，進行相應的比例混合，最后運行Miseq測序程序。使用cutadapt軟件將原始數據去引物，以確保數據是目標片段。用pandaseq軟件將不含引物PE（paired-end）序列拼接成長tags，對拼接長tags進行質控。接著用vsearch軟件對高質量長序列進行去除嵌合體。對去除嵌合體的高質量數據按相似度0.97進行OTU聚類，挑選代表序列，對代表序列進行物種注釋。同時使用qiime流程得到OTU豐度表和物種豐度表。

2.3 統計學處理：腸道菌群的數據用SPSS 15（SPSS,Chicago,IL,USA）進行分析，用秩和檢驗方法進行組間顯著性差異分析，采用R語言stats包的kruskal.test函數找出組間有明顯差異(P＜0.05)的物種。免疫部分數據以均值±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。組間比較，方差齊性者采用兩獨立樣本t檢驗，方差不齊者采用Kruskal-Wallis檢驗。

3 研究結果

3.1 患者基礎資料：13名肺癌患者經病理診斷均為腺癌，男性7例，女性6例，平均年齡59.46±7.34歲。參照中國臨床腫瘤學會（CSCO）非小細胞肺癌診療指南（2018年版）標準，所有患者中I期病例8例（61.5%），Ⅱ期病例5例（38.5%）。

3.2 OTU分析：分述如下。

3.2.1 OTU聚類及稀釋曲線：α多樣性分析是微生態中常用的方法，用來評估測序深度是否覆蓋全面，反應樣品內部物種的多樣性，并繪制出相應的物種豐富度稀釋曲線圖。詳見圖1。從圖中可以看出，隨著reads條數的增加，曲線不斷趨于平坦，說明本次使用的數據量是比較合理的。

圖1 樣品物種豐富度稀釋曲線圖

3.2.2 OTU韋恩圖分析：16S測序分析結果顯示，本研究中25個樣品共產生了250個OTU。其中共有OTU 173個，氣血瘀滯組有33個獨有的OTU，健康對照組有44個獨有的OUT，初步說明兩組之間OTU具有一定的差異。

圖2 OTU韋恩圖

3.3 差異物種分析：圖3顯示屬水平相對豐度前20的種系，其中有5個差異性菌屬，分別是普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（Clostridium XIVa）、毛螺菌屬（Lachnospiracea）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、放線菌屬（Actinomyces）。

圖3 屬水平差異性菌屬柱狀圖

3.4 血清IL-12和IFN-γ含量變化情況：從表1中可得，與對照組比較，氣滯血瘀組血清中的IL-12含量顯著降低（P＜0.01），IFN-γ含量降低，但無統計學差異（P＞0.05）。

表1 血清IL-12和IFN-γ含量變化情況（±s)

表1 血清IL-12和IFN-γ含量變化情況（±s)

注：與對照組比較，▲▲P＜0.01。

IFN-γ(pg/ml)715.88±119.29 704.83±87.06組別對照組氣滯血瘀組IL-12(pg/ml)57.81±5.66 40.20±11.72▲▲

4 分析與討論

本研究發現普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（Clostridium XIVa）、毛螺菌屬（Lachnospiracea）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）較健康組顯著富集；放線菌屬（Actinomyces）較健康組顯著降低。組間差異性分析血清IL-12和IFN-γ含量變化情況，發現與健康組比較，氣滯血瘀組血清中的IL-12含量顯著降低（P＜0.01），IFN-γ含量較健康組低，但無統計學差異。

中醫基礎理論與現代微生態學有著許多共通之處，腸道微生態的平衡與失衡實際上類似于中醫學中的正邪理論。從中醫學理論來看，氣滯血瘀屬于邪實，本研究入組的13名患者皆為早期肺癌，一般情況可，體內正氣尚能抗邪，處于邪實正不虛的狀態。倘若進一步發展成邪實正虛甚至一派虛象之地步，腸道微生態就很可能在其種類、數目、比例等各個方面進一步發生改變，宿主的免疫功能也將進一步產生變化。此外，在屬水平上，研究結果提示放線菌屬（Actinomyces）較健康組顯著降低。放線菌屬作為有腸道益生菌，可能直接影響著患者的免疫功能，亦或是其他原因有待證實。本研究組還檢測出諸多目前尚未證實的差異菌屬，即普氏菌屬（Prevotella）、梭菌屬（Clostridium XIVa）、毛螺菌屬（Lachnospiracea）。為了進一步驗證如上猜想，亟待總結并吸取本研究中存在的不足以進行后續更完善的研究。

中醫藥當前面臨著傳承不足、創新不夠的局面，嚴重制約著自身發展。中醫藥發展離不開現代醫學的檢測手段，迫切需要源源不斷地注入創新的“源頭活水”，在更多領域取得新突破。當前，免疫組學、蛋白組學、腸道微生態等方面技術為中醫藥研究突破提供了有力支撐。本文從氣滯血瘀型非小細胞肺癌患者腸道菌群與免疫功能的差異入手，并且進一步分析探討其深層次原因，推測肺癌的形成可能是部分腸道菌群通過調節宿主免疫能力的結果，這是一種行之有效的方法。我們必須秉持“傳承不泥古，創新不離宗”的原則，在傳承中創新，在創新中傳承，推動中醫藥高質量發展。傳承精華，守正創新，必將讓中醫藥獲得無限生機。