基于非線性化學指紋圖譜的羊乳廣譜摻假檢測研究

緱敬軒，劉義，劉征，樊成，董文賓

(1. 陜西科技大學食品與生物工程學院，西安710021；2. 陜西省產品質量監督檢驗研究院，西安710048)

0 引 言

羊乳中含有200 多種營養物質和生物活性因子，以其營養豐富、易于吸收等優點被視為乳品中的精品，被世界公認為乳制品中最接近母乳、營養成分全、易被人體吸收的乳品[1]。但是由于羊乳的產量低，供不應求，因此價格也遠遠高于牛乳[2]。為牟取暴利，在羊乳中摻雜使假現象不斷發生。摻假物質從傳統的摻水、淀粉、尿素等，發展到摻水解動物蛋白、水解植物蛋白、植脂末等，甚至還發現有亞硝酸鹽、吐溫80 等有毒物質[3]。目前的檢驗方法無論是傳統的理化檢驗方法還是基于現代儀器分析的檢測方法，大部分為具有高度專一性的單一物質檢測法[4]。但是在日常工作中，很難對每一批次樣品中所有可能的摻假物質一一檢測。檢測方法落后于摻假物質的更新，三聚氰胺事件發生之初，檢測部門都還沒搞清楚這究竟是一種什么物質，更不用說及時開發與之相適應的檢測方法[3]。因此迫切需要開發新的檢測方法能夠一次檢測即可判定樣品多種摻假物質的有無即針對多種摻假物質的廣譜檢測方法，并且對于一些新的潛在可能使用的摻假物質同樣有效。

非線性化學指紋圖譜技術是一種基于遠離平衡條件下的化學震蕩和化學湍流等非線性化學反應的技術，它通過樣品成分參與或影響非線性動力學反應，獲得反應過程中電位隨時間變化的曲線，即該樣品的指紋圖譜[5]。它將樣品所有成分作為一個整體來檢測，因此反映的是樣品的整體信息[6]。目前已有根據指紋圖譜的直觀特征或者系統相似度及其它圖譜參數進行藥材和食品真偽的鑒別以及摻假的定性定量檢測[5-8]。

本研究利用該技術建立羊乳摻假的廣譜檢測方法，以期通過一次檢測，即可排除多種摻假物質，從而減少檢測的工作量，并防止某些新型摻假物質的使用。

1 材料和方法

1.1 樣品

羊乳樣品購自三原興牧乳山羊養殖專業合作社及附近農戶家中共32 份。以氯化鈉、大豆蛋白胨、尿素和蔗糖作為待測摻假物質，隨機選取三份生鮮羊乳樣品分別添加0.5%、1%和5%的摻假物質，共得到摻假羊乳樣品36份。

1.2 試劑

硫酸，天津市紅碧化學試劑廠；溴酸鈉，廣州省化學試劑工程技術研究開發中心；丙酮，天津利安隆博華醫藥化學有限公司；硫酸錳，天津市福晨化學試劑廠；氯化鈉，天津市天力化學試劑有限公司；尿素，天津恒興化學試劑制造有限公司；蔗糖，天津市科密歐化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。大豆蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司；生物試劑；水為重蒸蒸餾水。

1.3 儀器

MZ-1B 型非線性化學指紋圖譜分析儀，湖南尚泰科技有限公司；217 型復合甘汞電極和213 型金屬鉑電極，上海精密科學儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 測定方法

非線性化學指紋圖譜測定方法，同馬永杰[9]。

1.4.2 分析方法

以所有羊乳樣品指紋圖譜參數的平均值為羊乳標準品的指紋圖譜參數，計算各個純羊乳樣品及摻假樣品與羊乳標準品的相似度值[10]，以純羊乳最低相似度值為臨界值，若待測樣品的相似度值低于臨界值，則判定該樣品為不合格或摻假樣品，若待測樣品的相似度值大于臨界值，則判定待測樣品為正常。對于未發生震蕩的樣品可直接判定為摻假或者不正常樣品。數值處理及繪圖分別采用Matlab2014和origin2018。

2 結果及討論

2.1 純羊乳相似性比較

采用非線性指紋圖譜測定方法測定所有純羊乳樣品共計32 份的指紋圖譜，并統計指紋圖譜參數，以所有樣品指紋圖譜參數的平均值作為純羊乳標準品的參數，然后計算所有純羊乳樣品與標準品之間的相似度值，結果如表1 所示，所有純羊乳與標品相似度值在91.8%～83.4%，其Rsd為2.91%。

2.2 圖譜比較

樣品不同成分含量的變化都會影響到指紋圖譜的圖形，純羊乳樣品由于成分含量相似，因此指紋圖譜也具有相似性，不同樣品的指紋圖譜直觀差異不大，見圖1。若待測樣品的指紋圖譜與正常純羊乳相比有的顯著差異則說明該樣品為摻假乳或非正常生鮮乳。

圖1 純羊乳指紋圖譜

圖2 含氯化鈉羊乳樣品的指紋圖譜

含氯化鈉的樣品均未發生震蕩，電位-時間曲線為平滑曲線，與純羊乳的震蕩曲線完全不同，故摻氯化鈉0.5%以上的樣品可直接通過圖形的差異判定樣品為摻假或不合格羊乳。

圖3 含大豆蛋白胨羊乳樣品的指紋圖譜

表1 純羊乳指紋圖譜參數及其相似度范圍

添加大豆蛋白胨的樣品中，5%含量的未發生震蕩，因此曲線與正常羊乳曲線明顯不同，可直接判定。而1%和0.5%含量的指紋圖譜與純羊乳的指紋圖譜具有一定地相似性，故需進一步通過相似度比較進行判定。

圖4 含尿素羊乳樣品的指紋圖譜

添加不同濃度尿素的樣品雖然均發生震蕩，但是指紋圖譜與純羊乳的圖譜直觀上具有明顯的差異，無論是震蕩起始時間、振幅還是震蕩壽命等與純羊乳明顯不同，因此也可通過指紋圖譜的直觀比較判定。

圖5 含蔗糖羊乳樣品的指紋圖譜

5%蔗糖摻假樣品的指紋圖譜與純羊乳指紋圖譜圖形差異顯著，也可以通過直觀的圖形觀察直接判定，但1%和0.5%的蔗糖樣品震蕩圖形需要通過相似度計算來進行判定。

故通過圖形的直觀比較，可判定添加0.5%以上氯化鈉或尿素樣品和5%以上大豆蛋白胨或蔗糖的樣品為不正常或摻假樣品，而添加量小于5%的大豆蛋白胨或蔗糖樣品還需通過相似度計算進行判定。

2.3 相似度比較

以32 個羊乳樣品的參數平均值作為羊乳標品的指紋圖譜參數。計算純羊乳與標品相似度，相似度值越高說明樣品與標品的差異越小，相似度值越小，則樣品與標品的差異越大，相似度值過小，則說明樣品中可能摻假或者不合格。本研究中純羊乳相似度值最高91.8%，最低83.4%，平均87.4%.故以83.4%作為相似度臨界值，若待測樣品的相似度值低于相似度臨界值則判定為摻假或不合格羊乳；反之則判定為未摻假或合格的純羊乳。

分別抽取三個不同純羊乳樣品，添加不同濃度的氯化鈉、大豆蛋白胨、尿素和蔗糖等。測定其指紋圖譜及其參數，并計算不同濃度摻假物樣品與純羊乳標品相似度，每個樣品平行測定三次，取其平均值，結果如圖6所示。

圖6 摻假羊乳樣品相似度

由圖6 可知，除添加氯化鈉樣品及含5%大豆蛋白胨樣品未發生震蕩，其相似度值為零外，0.5%和1%大豆蛋白胨樣品以及所有含尿素樣品的相似值均小于臨界值83.4%，含蔗糖的樣品中，添加5%蔗糖的樣品相似度值均小于臨界值83.4%，而添加1%和5%蔗糖的兩類樣品相似度值或大于或小于臨界值，但均接近臨界值83.4%，故這兩類樣品還不能用臨界值的方法進行判定是否摻假。

就以上樣品測定結果來看，氯化鈉、大豆蛋白胨和尿素在0.5%添加量水平可以用該方法定性檢測，而蔗糖在5%添加水平可判定是否摻假，低于5%則不能確定是否摻假。因此對于以上幾種摻假物質，在5%的添加水平該方法可以有效檢測。摻假以獲得非法高利潤為目的，通常摻假量會足夠大[11]。因此該方法可用于純鮮羊乳收購中以上幾種摻假物質的定性廣譜檢測。

3 結 論

本研究對純生鮮羊乳及添加不同濃度氯化鈉、大豆蛋白胨、尿素和蔗糖的生鮮羊乳的非線性指紋圖譜進行研究和對比。結果表明通過圖譜的直觀比較即可判定純生鮮羊乳添加0.5%以上氯化鈉或尿素樣品和5%以上大豆蛋白胨或蔗糖的摻假行為，而通過比較相似度值的方法可以判定氯化鈉、尿素和大豆蛋白胨3 種物質在0.5%以上濃度的摻假行為以及5%以上蔗糖摻假行為, 因此該方法可用于生鮮羊乳的以上幾種摻假物質的廣譜檢測。隨著考察的摻假物質種類的增加，該方法能夠確定檢測的摻假物質的種類必然也會增加。該方法的最大的優點在于檢測方法的廣譜性，即一次測定，就可檢測生鮮羊乳中多種摻假物質的有無，本研究通過相似度值可同時判定是否存在氯化鈉、大豆蛋白胨、尿素和蔗糖四種物質的摻假行為，隨著更多摻假物質的檢測驗證，相似度法能夠判定的摻假物質必然會更多，從而極大的減少生鮮羊乳食品安全檢測的工作量。在實踐中如果純生鮮乳的樣品數量再多一些，并且能夠按照季節、地區或者羊的品種等因素分類建立標準乳及相似度臨界值，則判定模型有可能會更加準確。