嬰幼兒乳粉中維生素B12檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果分析

陳秀芬，梁穎思，黃家欣，周露

（廣東省食品檢驗(yàn)所，廣州510435）

0 引 言

維生素B12的檢測(cè)方法主要有微生物法、化學(xué)分析法和試劑盒法[1-3]。微生物法靈敏度和準(zhǔn)確度較高[4]，所以公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)[5]和美國(guó)藥典(USP)[6]以及中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[7]都將該方法作為檢測(cè)的主要方法和仲裁方法[8]，但檢測(cè)步驟繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)和易受干擾[9]；化學(xué)分析法相對(duì)快速簡(jiǎn)單，但存在錯(cuò)測(cè)漏測(cè)和易受干擾的可能[10]；試劑盒法基于微生物法原理，步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短，結(jié)果準(zhǔn)確性較高。

實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)是按照預(yù)先規(guī)定的條件，由兩個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢測(cè)物品進(jìn)行檢測(cè)的組織、實(shí)施和評(píng)價(jià)[11]，并對(duì)內(nèi)部質(zhì)量控制活動(dòng)進(jìn)行監(jiān)控，確保檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)室與廣州市食品檢驗(yàn)所對(duì)嬰幼兒乳粉中維生素B12進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)實(shí)驗(yàn)，比對(duì)結(jié)果滿(mǎn)意。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

廣州市食品檢驗(yàn)所發(fā)放的一包約30 g 比對(duì)樣品奶粉，包裝為塑料密封袋，完好無(wú)破損。

菌種：萊士曼氏乳桿菌（Lactobacillus leichmannii）ATCC 7830（美國(guó)Microbiologics公司）。

試劑：乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基和乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基、維生素B12試劑盒（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；維生素B12試劑盒（德國(guó)拜發(fā)公司）；維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基（美國(guó)BD 公司）；維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品（編號(hào)CCFD200070，純度為99.6%，購(gòu)于CATO Reseach Chemicals Inc.）；水磷酸氫二鈉，廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；無(wú)水偏重亞硫酸鈉，上海麥克林生化有限公司；一水檸檬酸，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)。

FE 型 pH 計(jì)，梅特勒-托利多集團(tuán)；Allegra64R 型離心機(jī)，美國(guó) Beckman Coulter；UV-2600 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；SX-700 型高壓滅菌器，日本TOMY 公司；AC2-4S1 型生物安全柜，新加坡ESCO 公司；SW-CJ-2F 型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；800-TS 型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 公司。

1.2 方法

1.2.1 微生物法[7]

（1）測(cè)試菌懸液的制備。將活化后的萊士曼氏乳桿菌接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18～24 h。將培養(yǎng)液以 2 000～3 000 r/min 離心 2～3 min，棄去上清液，加入10 mL 生理鹽水，混勻，重復(fù)以上步驟3 次，再加10 mL 生理鹽水，混勻吸適量該菌懸液于10 mL生理鹽水中，混勻制成測(cè)試菌懸液。

以生理鹽水做空白，于550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)測(cè)試菌液的透光率，用生理鹽水或菌液調(diào)整透光率至60%～80%之間。

（2）前處理液的制備。稱(chēng)取無(wú)水磷酸氫二鈉1.3 g，無(wú)水偏重亞硫酸鈉1.0 g，一水檸檬酸1.2 g，用100 mL水溶解。

（3）樣品的前處理。稱(chēng)取約6 g 樣品于250 mL 錐形瓶中，用10 mL 前處理混合后，再加150 mL 水，與121 ℃水解10 min，冷卻后調(diào)pH值至4.5±0.2，再用水定容至250 mL，過(guò)濾。移取濾液5 mL，加入水20～30 mL。調(diào)pH 值至6.8±0.2，用水定容至100 mL。

（4）維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作。按表1 順序加入水、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作液和維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基于培養(yǎng)管中，一式三份。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 mL

（5）樣品的制作。按表2 順序加水、樣品溶液和維生素B12測(cè)定培養(yǎng)基于培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。

表2 待測(cè)液的制作 mL

（6）滅菌、培養(yǎng)和測(cè)定。將所有標(biāo)準(zhǔn)試樣管和樣品管121 ℃滅菌5 min。再將上述試管迅速冷卻至30 ℃以下，并向各試管滴加1 滴（50 μg）測(cè)試菌液（標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)管中空白S1 除外），放入恒溫培養(yǎng)箱36 ℃±1 ℃培養(yǎng)19～20 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在波長(zhǎng)550 nm 下，測(cè)定每支試管的吸光度。

1.2.2 試劑盒法（進(jìn)口與國(guó)產(chǎn)）

進(jìn)口試劑盒和國(guó)產(chǎn)試劑盒按照說(shuō)明書(shū)操作。

（1）樣品的前處理。試劑盒法（進(jìn)口）稱(chēng)取1 g（精確至0.0001 g）樣品溶入40 mL 蒸餾水中，試劑盒法（國(guó)產(chǎn)）稱(chēng)取1 g（精確至0.01 g）樣品溶入20 mL 樣品處理液（維生素B12保護(hù)液與蒸餾水比例為1:50）中，搖勻。95 ℃水浴30 min，期間每5 min 振蕩一次 ，然后迅速冷卻至室溫，并用0.2 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾至無(wú)菌離心管中。將無(wú)菌濾液稀釋備用。

（2）培養(yǎng)基制備。在含有培養(yǎng)基的玻璃瓶中加入10 mL 無(wú)菌水，95 ℃ 水浴 5 min，期間每 2 min 振蕩一次，然后迅速冷卻至室溫，并用0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾至無(wú)菌離心管中備用。其中，試劑盒法（國(guó)產(chǎn)）需將維生素B12檢測(cè)菌球溶解于培養(yǎng)基中，振蕩，搖勻。

（3）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。試劑盒法（進(jìn)口）：在維生素B12標(biāo)準(zhǔn)瓶中加入2.4 mL 無(wú)菌水，搖勻。取6 個(gè)無(wú)菌管按照表3 配置（0.03～0.18）μg/100 g 系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)稀釋質(zhì)量分?jǐn)?shù)

試劑盒法（國(guó)產(chǎn)）：在維生素B12標(biāo)準(zhǔn)瓶中加入5 mL 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（維生素B12保護(hù)液與1×維生素B12緩沖液比例為1:50），搖勻。取8 個(gè)無(wú)菌管按照表4 配置0.02～0.16 μg/100 g系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)稀釋質(zhì)量分?jǐn)?shù)

（4）上板培養(yǎng)。取相應(yīng)數(shù)量的微孔板條至板架，試劑盒法（進(jìn)口）加入150 μL 培養(yǎng)基和150 μL 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，試劑盒法（國(guó)產(chǎn)）加入100 μL 培養(yǎng)基和100 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，再用密封膠片將所有微孔密封，37 ℃黑暗條件下培養(yǎng)44～48 h。

（5）讀數(shù)及結(jié)果分析。孵育完畢后，將微孔板倒置并振蕩搖勻，揭去粘合箔并去除微孔液體表面的氣泡，用酶標(biāo)儀在630 nm 或540 nm 條件下讀數(shù)。結(jié)果分析時(shí)使用ELISA 專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)分析軟件中4-Parameter計(jì)算方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3 質(zhì)量控制措施

為保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可信度, 本次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)根據(jù)試樣C00076 中B12含量水平、方法選擇以及實(shí)驗(yàn)室條件, 對(duì)B12的測(cè)定采用以下質(zhì)量控制措施:平行實(shí)驗(yàn)、加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)、質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)和方法比對(duì)。質(zhì)量控制措施的具體內(nèi)容如下:

（1）平行實(shí)驗(yàn)。采用2 平行，即稱(chēng)取2 份樣品，在重復(fù)性條件下獲得兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果，計(jì)算平行結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Reative Standard Deviation，RSD），分析測(cè)定結(jié)果的精密度。

（2）加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。在試樣C00076 中加入已知濃度的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)工作液，加標(biāo)量為50 ng，計(jì)算加標(biāo)回收率，分析測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

（3）質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)。選用購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心的含B12嬰兒配方乳粉作為質(zhì)控樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量控制。

（4）實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)。與廣東省廣州市食品檢驗(yàn)所對(duì)微生物法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，在再現(xiàn)性條件下獲得測(cè)定結(jié)果，計(jì)算再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差（Reproducibility Stan?dard Deviation），檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的可信度。

（5）方法比對(duì)。采用微生物法和試劑盒法進(jìn)行方法比對(duì)，分析測(cè)定結(jié)果受試驗(yàn)方法差異的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法線(xiàn)性分析結(jié)果

分別用微生物法和試劑盒法（分別包括進(jìn)口試劑盒和國(guó)產(chǎn)試劑盒）對(duì)試樣C00076 進(jìn)行測(cè)定，以維生素B12含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，根據(jù)四參數(shù)方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，3 種方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1～圖3 所示，其線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限如表5 所示。 由表5 可知，微生物法所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)為0.9151，試劑盒法（進(jìn)口）為0.9995，試劑盒法（國(guó)產(chǎn)）為0.9979，可知試劑盒法（進(jìn)口試劑盒）的線(xiàn)性關(guān)系更好。

圖1 微生物法維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱(chēng)取6 份試樣C00076 按照上述實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行分析，測(cè)定結(jié)果如表6所示。微生物法和試劑盒法（進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)）的測(cè)定結(jié)果的RSD分別為5.92%、4.00%和8.00%，RSD均小于10%，滿(mǎn)足GB5413.14-2010的要求[8]。

圖2 試劑盒法（進(jìn)口）維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖3 試劑盒法（國(guó)產(chǎn)）維生素B12標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表5 線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限 μg/100g

表6 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 μg/100g

2.3 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱(chēng)取試樣C00076，加入0.5 mL 濃度為100 ng/mL的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液，微生物法和試劑盒法（進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)）的測(cè)定結(jié)果的加標(biāo)回收率如表7 所示，參照GB/T 27404-2008 附錄F，回收率均在80%～110%范圍內(nèi)，均符合要求。

表7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果

稱(chēng)取質(zhì)控樣品Q(chēng)C17038 與待測(cè)試樣C00076 同時(shí)進(jìn)行前處理，再各自按照上述實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，質(zhì)控樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表8 所示。由表8 可以看出，微生物法和試劑盒法（進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)）檢測(cè)出的質(zhì)控樣品結(jié)果均在滿(mǎn)意值范圍內(nèi)，說(shuō)明所選擇的檢測(cè)方法合適，檢測(cè)結(jié)果可靠。

表8 質(zhì)控樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果 μg/100g

2.5 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)室與廣東省廣州市食品檢驗(yàn)所采用微生物法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，結(jié)果如表9 所示。由表9 可以看出，本實(shí)驗(yàn)室與廣東省廣州市食品檢驗(yàn)所維生素B12報(bào)告值得再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差為0，表明比對(duì)結(jié)果滿(mǎn)意。

表9 實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)結(jié)果 μg/100g

2.6 微生物法和試劑盒方法比較

本次實(shí)驗(yàn)維生素B12微生物法檢測(cè)值（1.7 μg/100 g）比試劑盒法檢測(cè)值高（進(jìn)口為1.0 μg/100 g；國(guó)產(chǎn)為0.8 μg/100 g）（表6），可知，微生物法比試劑盒法（進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)）的結(jié)果都高。微生物法與試劑盒法（進(jìn)口）的報(bào)告值相對(duì)偏差為51.9%，加標(biāo)回收率相對(duì)偏差為3.27%；微生物法與試劑盒法（國(guó)產(chǎn)）的報(bào)告值相對(duì)偏差為72.0%，加標(biāo)回收率相對(duì)偏差為19.2%；試劑盒法（進(jìn)口）與試劑盒法（國(guó)產(chǎn)）的報(bào)告值相對(duì)偏差為11.1%，加標(biāo)回收率相對(duì)偏差為16.0%。方法比對(duì)的報(bào)告值相對(duì)偏差均大于10%，表明測(cè)定結(jié)果受到實(shí)驗(yàn)方法差異的影響較大。有學(xué)者研究表明，商品化試劑盒法線(xiàn)性關(guān)系良好、人員比對(duì)重復(fù)性良好[13]和減少了洗滌污染等問(wèn)題，但是使用試劑盒需要進(jìn)行評(píng)價(jià)和方法確認(rèn)[14]。另外，試劑盒法檢測(cè)維生素B12的結(jié)果顯著低于國(guó)標(biāo)法結(jié)果[15-16]，GB 5413.14-2010[7]中試樣提取過(guò)程用到的偏重亞硫酸鈉能使不穩(wěn)定的鈷胺素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的氰鈷胺素或者亞硫酸合鈷胺素，利于維生素B12提取，而商品化試劑盒一般采用蒸餾水提取維生素B12，可能使得樣品中維生素B12提取不徹底，進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果低于實(shí)際值，且但僅能檢測(cè)添加的維生素B12，或者也可采用氰化物作為提取液，但氰化物是劇毒，不易獲得也不適于長(zhǎng)期檢測(cè)。因此，應(yīng)盡量避免采用試劑盒法檢測(cè)食品中的天然維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的食品或者檢測(cè)強(qiáng)化和天然維生素B12總和的食品。

3 結(jié) 論

本次實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，對(duì)試樣C00076 的維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果為1.7 μg/100 g，與廣州市食品檢驗(yàn)所進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果滿(mǎn)意。

微生物法檢測(cè)維生素B12雖然操作步驟繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)和受外部影響大，但是準(zhǔn)確度和靈敏度較高，關(guān)鍵在于控制好接種菌的活力和數(shù)量、實(shí)驗(yàn)玻璃器具除雜、樣品前處理的pH 值變化范圍、培養(yǎng)基和嚴(yán)格無(wú)菌操作。為了提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確度，可以參考試劑盒法的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)對(duì)現(xiàn)有的微生物法進(jìn)行改進(jìn)：（1）實(shí)驗(yàn)全程采用一次性無(wú)菌塑料試管和容器，或者將玻璃儀器專(zhuān)項(xiàng)專(zhuān)用放置，每一次實(shí)驗(yàn)完畢后都采用熱肥皂水浸泡清洗、180 ℃，3 h 干燥除雜處理；（2）參考樣品快速前處理方法, 從而縮短前處理時(shí)間；（3）將培養(yǎng)基和樣品進(jìn)行過(guò)濾操作，減少對(duì)干擾吸光度的因素；（4）將實(shí)驗(yàn)菌株預(yù)先制成凍干粉或者制成甘油管于液氮或-80 ℃冰箱中更易于保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)再用植物乳桿菌肉湯復(fù)蘇、連續(xù)傳代2～3 代后使用另外有研究將萊士曼氏乳桿菌按標(biāo)準(zhǔn)制成接種液，再與甘油混勻分裝凍存于-80 ℃冰箱，接種液可隨時(shí)使用，避免實(shí)驗(yàn)前耗費(fèi)4～5 d 制備菌液, 實(shí)現(xiàn)來(lái)樣當(dāng)天檢測(cè), 縮短檢測(cè)周期和節(jié)約成本[17]；（4）采用空白無(wú)菌微孔板代替試管培養(yǎng)，酶標(biāo)儀代替紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)出吸光度，ELISA 專(zhuān)業(yè)統(tǒng)計(jì)分析軟件中4-Parameter 計(jì)算方法代替中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.14-2010[7]中的繁瑣計(jì)算，從而提升檢測(cè)效率。將測(cè)定維生素B12質(zhì)量分?jǐn)?shù)的微生物方法進(jìn)行改進(jìn)，可以較大程度的縮短了檢測(cè)時(shí)間和降低試驗(yàn)成本[18]，有利于建立高效實(shí)驗(yàn)流程和加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理，保證結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確度，加強(qiáng)微生物法在實(shí)驗(yàn)室間的推廣。