分泌型卷曲相關蛋白2抑制人結直腸癌細胞系SW480的增殖和遷移

周 菁，李索妮

(陜西省腫瘤醫院 腫瘤內科，陜西 西安 710061)

結直腸癌(colorectal cancer)作為常見的消化道惡性腫瘤之一，近幾年發病率逐漸增高。僅2014年中國結直腸癌新發病例就有79 180例，病死率高達13.27/10萬[1]。其中癌細胞的轉移是致死的主要原因[2]。因此，探索結直腸癌細胞轉移的分子機制有望為其治療提供有效的靶點。

分泌型卷曲相關蛋白2 (secreted frizzled-related protein 2，SFRP2)作為SFRP家族成員之一，三維結構中存在一個富含半胱氨酸的結構域，與Wnt配體高度同源，因此可以作為拮抗劑抑制Wnt/β-catenin信號通路[3]。SFRP2在一些惡性腫瘤中的表達失調已被報道，但是它在這些癌中的作用機制不盡相同。比如，在骨肉瘤[4]、腎癌[5]和乳腺癌[6]中呈現高表達具有促癌作用；然而，在胃癌[7]、結直腸癌[8]、口腔鱗癌[9]中，SFRP2高甲基化導致其表達下調，被認為具有抑癌作用。目前大多數學者只關注于SFRP2甲基化在結直腸癌檢測中的應用，其抑癌的具體分子機制尚不清楚。本文通過檢測SFRP2在結直腸癌細胞的表達，分析其對結直腸癌細胞系SW480增殖、遷移、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常結腸上皮細胞系(human normal colonic epithelial cell line)HCoEpiC、結直腸癌細胞系(human colorectal cancer cell line)SW480和人胚胎腎上皮細胞系HEK293T(美國典型培養物保藏中心)；RPMI1640和DMEM培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素(Thermo Fisher Scientificals公司)；慢病毒包裝試劑盒(Origene公司)；CCK-8、BCA試劑盒(北京碧云天生物公司)；SFRP2、低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、Twist抗體(Abcam公司)；IDF-11774(Selleck公司)；FastKing一步法反轉錄-熒光定量試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；超低溫高速離心機[SIGMA(3K15型)]。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養：將HCoEpiC和SW480培養于含10%胎牛血清，1%青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養基中。培養條件：37 ℃，5% CO2。每隔2 d更換新鮮培養基。HEK293T細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養條件同上。

1.2.2 RT-qPCR檢測mRNA水平：取處于對數增殖期細胞，采用RNA提取試劑盒提取RNA，Nanodrop測量260/280處吸光度值。取1 μg RNA作為模板，采用FastKing一步法反轉錄-熒光定量試劑盒檢測mRNA水平，以GAPDH作為內參。每組實驗設置3個復孔。mRNA表達量比較采用2-△△Ct計算，其中Ct=△Ct目的-△Ct內參，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組。引物由上海生工合成。SFRP2上游引物：5′-GGAGACCAAGAGCAAGACCAT-3′，下游引物：5′-GCACTGCAAGCTGTCTTTGA-3′；β-catenin上游引物：5′-TACTGTCCTTCGGGCTGGTG-3′，下游引物：5′-CGGGTATCCTGATGTTGCGC-3′；Snail上游引物：5′-GGCTCCTTCGTCCTTCTCCTCTAC-3′，下游引物：5′-CCAGGCTGAGGTATTCCTTGTTGC-3′；HIF-1α上游引物：5′-TGCACAGGCCACATTCACGTA-3′，下游引物：5′-GTTCACAAATCAGCACCAAGCA-3′；Twist上游引物：5′-CGGCCAGGTACATCGACT-3′，下游引物：5′-CCATCCTCCAGACGGAGA-3′；GAPDH上游引物：5′-CTGACTTCAACAGCGACACC-3′，下游引物：5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。

1.2.3 Western blot檢測蛋白水平：取處于對數增殖期的細胞，加入含有1 μmol/L PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r/min,離心30 min，收集上清。采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣于分離膠為12%的SDS-PAGE上，160 V恒壓1 h。濕轉法恒流250 mA轉移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1h；加入一抗[SFRP2(1∶1 000)；β-catenin(1∶1 000)；Snail(1∶1 000)；HIF-1α(1∶1 000)；Twist(1∶5 000)]。4 ℃孵育過夜，PBST洗滌，二抗室溫孵育1 h。曝光顯影。

1.2.4 構建敲減SERP2穩轉SW480細胞株及分組：首先將HEK293T細胞接種于6 cm培養皿中，孵育過夜后，進行轉染，步驟按照說明書操作。48 h后，采用0.45 μm的濾膜過濾收集含有慢病毒的細胞上清。同時，將SW480接種至6孔板中，待細胞匯合度達到70%，加入收集到的含有慢病毒的細胞上清，4 d后，采用Western blot和RT-qPCR 檢測SERP2的敲減效率。實驗分組如下：1)shNC組，轉染control shRNA;2)shSERP2組，轉染SERP2 shRNA;3)shSERP2+ IDF-11774組，轉染SERP2 shRNA的細胞，同時采用20 μmol/L IDF-11774處理。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力：將2×103個細胞接種于96孔板中，繼續培養12、24和48 h后，向每孔內加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h后，檢測酶標儀450 nm處的吸光度值。

1.2.6 Transell小室法實驗檢測細胞遷移、侵襲能力：遷移：分別收集細胞，無血清培養液重懸，取5×104細胞接種于Transwell小室上層，下層加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，培養48 h后，用棉簽將上層小室內中的細胞擦去，結晶紫染色30 min。倒置顯微鏡下觀察細胞遷移數。侵襲：預先在Transwell小室上層鋪一層Matrigel 基質膜，其他同遷移實驗。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 SFRP2在結直腸癌細胞系SW480及結直腸癌組織中的表達

SW480細胞中SFRP2的轉錄和翻譯水平顯著低于HCoEpiC細胞(P<0.01)(圖1A,B)。另外，生物信息學數據庫GEPIA顯示(圖1C)癌組織中SERP2的表達水平低于癌旁組織(P<0.05)。

2.2 敲降SERP2后SW480細胞增殖、遷移、侵襲能力增強

與shNC組比較，shSFRP2組細胞中SFRP2的表達水平顯著降低(P<0.01)(圖2A,B)；而增殖、遷移和侵襲能力顯著提高(P<0.001)(圖2C～E)。

*P<0.05 compared with normal samples；**P<0.001 compared with HCoEpiC group圖1 SFRP2在結直腸癌細胞系SW480(A和B) 及結直腸癌組織中的表達(C)Fig 1 Expression of SFRP2 in colorectal cancer cell line SW480 (A and B) and colorectal cancer

A.Western blot;B.RT-qPCR;C.CCK-8;D,E.Transwell;*P<0.001 compared with shNC group圖2 SERP2對SW480細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響Fig 2 Effect of SERP2 on proliferation,migration and invasion of SW480 n=3)

2.3 HIF-1α和Twist在SW480細胞中的表達

與shNC組比較，shSFRP2組HIF-1α和Twist表達水平明顯提高(P<0.01)(圖3)。

2.4 HIF-1α抑制劑(IDF-11774)降低SERP2敲降對SW480細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

與shSFRP2組比較，shSFRP2+IDF-11774組細胞增殖、遷移、侵襲能力顯著降低(P<0.001) (圖4)。

3 討論

研究發現54.39%的結直腸癌患者血漿樣本中SFRP2存在高度甲基化[10]。因此，目前認為SFRP2是結直腸癌的抑癌基因。但是其與結直腸癌發生、發展的分子機制尚未清楚。

本研究首先確定了SFRP2在結直腸癌細胞系SW480中表達量低于正常上皮細胞。初步表明SFRP2在結直腸癌中可能是抑癌基因。SFRP2在Wnt通路中起關鍵作用，在絨(毛)膜癌[11]、骨肉瘤[4]、乳腺癌[6]中SFRP2能夠促進癌細胞的侵襲、轉移，具有促癌作用。然而在卵巢癌中發現TET1可以通過激活SFRP2表達抑制癌細胞的上皮間質轉化，提示SFRP2具有抑癌作用[12]。本文敲降SFRP2后，發現結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力顯著提高，表明了SFRP2在結直腸癌中為抑癌基因。

β-catenin、Snail、Twist是與EMT相關的轉錄因子，過表達能促進腫瘤細胞的上皮間質轉化，導致腫瘤細胞從原發部位脫落，向周邊組織轉移[13]。本研究發現敲降SFRP2后，Twist表達水平顯著提高，而β-catenin、Snail的表達水平并未受到影響。所以推測SFRP2通過調控Twist的表達抑制結直腸癌細胞的轉移。目前已證實HIF-1α可以通過激活Twist的表達促進結直腸癌的增殖侵襲[14]。另外研究還發現HIF-1α表達受Wnt/β-catenin信號通路調控[15]，而SFRP2是Wnt配體的拮抗劑，因此推斷SFRP2可能通過阻斷Wnt/β-catenin信號傳導來抑制HIF-1α表達，從而限制結直腸癌的進展。基于該推測，本文檢測了HIF-1α在結直腸癌的表達，發現敲降SFRP2后，SW480細胞中HIF-1α表達水平顯著升高。證實了在結直腸癌中SFRP2作為Wnt配體的拮抗劑首先抑制了HIF-1α表達，然后阻滯Twist激活，上皮間質轉化受阻，最終控制了癌細胞的轉移。緊接著，本文采用HIF-1α抑制劑(IDF-11774)刺激shSFRP2 SW480細胞，發現IDF-11774可以降低SERP2敲降對SW480細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。進一步說明了SFRP2通過調控HIF-1α-Twist信號通路抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲。

*P<0.001 compared with shNC group圖3 HIF-1α和Twist在SW480細胞中的表達Fig 3 Expression of HIF-1α and Twist in SW480 cells n=3)

*P<0.001 compared with shSFRP2 group圖4 IDF-11774對SW480細胞增殖(A)、遷移和侵襲能力(B和C)的影響Fig 4 Effect of IDF-11774 on proliferation (A),migration and invasion (B and C) of SW480 cells n=3)

綜上所述，SFRP2可以抑制結直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲，可能是參與結直腸癌發生的負調控因子。后續可以嘗試設計開發SFRP2激活劑用于結直腸癌治療。