斑石鯛和條石鯛線粒體基因組密碼子使用分析

孟 乾，張志勇，張志偉，張曹進，陳淑吟，祝 斐，賈超峰，曹廣勇

( 江蘇省海洋水產研究所，江蘇省海水魚類遺傳育種重點實驗室，江蘇 南通 226007 )

在生物體內的蛋白質翻譯過程中，編碼同一種氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼子，而不同基因在蛋白質編碼過程中會傾向于使用一些特定的同義密碼子，叫作同義密碼子的使用偏性，不同物種及不同功能基因的密碼子使用偏性均存在差異[1-5]。線粒體DNA(mtDNA)具有進化速率快、核苷酸替代率高及母性遺傳等特點，已成為魚類進化、鑒定及種質遺傳等研究的重要遺傳分子標記，mtDNA的密碼子偏性研究有助于推進魚類的鑒定、發育及遺傳育種等研究。

斑石鯛(Oplegnathuspunctatus)和條石鯛(O.fasciatus)均屬鱸形目、石鯛科、石鯛屬，在我國沿海均有分布，且具有美觀、營養豐富、生長快及抗逆性強等特點，具有較高的觀賞與經濟價值，其海水養殖產業具有發展前景[6-9]。目前，國內外對條石鯛和斑石鯛的研究主要集中在選擇育種、人工繁殖技術、病害及分類等方面[7-15]，而在mtDNA水平研究較少。孫鵬等[16]以mtCOX1和Cytb片段探討了條石鯛野生種群多樣性。此外，斑石鯛和條石鯛間已實現人工雜交，二者在基于mtCOX1、Cytb基因和D-loop序列片段的遺傳差異比較中顯示親緣關系較近[17-18]。筆者以斑石鯛和條石鯛mtDNA編碼蛋白基因序列為研究對象進行密碼子偏好性分析，并與斑馬魚(Daniorerio)、金鼓魚(Scatophagusargus)、黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)和真鯛(Pagrosomusmajor)mtDNA編碼蛋白質的基因序列進行比對和密碼子偏好性聚類分析，探討石鯛科與其他物種間的親緣關系，以期為探討兩者間的近緣雜交育種、種質資源等研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 序列材料

本研究所用斑石鯛、條石鯛、斑馬魚、金鼓魚、黑鯛和真鯛的線粒體基因組基因序列均來源于美國國立生物技術信息中心GenBank數據庫(表1)。

表1 斑石鯛、條石鯛及其他物種的登錄號

1.2 密碼子分析指標和方法

相對密碼子使用度，是指對于某一特定的密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子間的相對概率，可直觀地反映密碼子使用的偏好性。當某一密碼子相對密碼子使用度=1，代表該密碼子的使用沒有偏好性；相對密碼子使用度>1時，表明該密碼子為使用相對較多的密碼子，反之亦然。第i個氨基酸的第j個密碼子的相對密碼子使用度(RSCUij)的計算公式[3]如下：

式中,xij是編碼第i個氨基酸的第j個密碼子的出現次數，ni是編碼第i個氨基酸的同義密碼子的數量(值為1～6)。

用CodonW對斑石鯛和條石鯛mtDNA中編碼蛋白基因序列分別進行分析,得出每條序列中各密碼子的相對密碼子使用度以及密碼子的第3位堿基中A、U、G、C的含量在第3位堿基總量中所占的比率(分別為A3s、U3s、G3s、C3s)；用Microsoft Excel 2006統計分析數據。

1.3 因子相關性及聚類分析

將各密碼子含量以標準得分存為變量作為橫軸，相對密碼子使用度值以1為原點作為縱軸，以Microsoft Excel 2006作散點圖；每個物種的mtDNA編碼蛋白質的基因作為一個對象，將密碼子的相對密碼子使用度作為變量，以偏好性密碼子的相對密碼子使用度(大于1)對基因的密碼子使用偏好性進行聚類分析；去除斑石鯛等6個物種的mtDNA的ATP8、ND3和ND4L(序列長度較短)，每個基因(ND1、ND2、COX1、COX2、ATP6、COX3、ND6、ND4、ND5、Cytb)各自看成一類并以Mega 5.1進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 斑石鯛與條石鯛mtDNA編碼蛋白質基因的密碼子偏好性

斑石鯛和條石鯛的mtDNA編碼蛋白基因中的C3s分別為31.21%和35.86%，均大于A3s、U3s、G3s(表2)，可見斑石鯛和條石鯛的mtDNA編碼蛋白基因偏愛使用以C堿基結尾密碼子，避免使用以G結尾密碼子。

表2 斑石鯛和條石鯛mtDNA編碼蛋白質基因密碼子的A3s、U3s、G3s、C3s %

斑石鯛以UUC、ACC等30個密碼子的相對密碼子使用度均大于1(表3)，為斑石鯛mtDNA編碼蛋白基因的偏好性密碼子，條石鯛比斑石鯛的mtDNA編碼蛋白基因的偏好性密碼子少2個(CCA和GUC)，其中尤其偏愛使用以C結尾的密碼子(斑石鯛除AUC外,條石鯛除AUC和GUC外，其余的均為偏好性密碼子)，其次偏愛以A結尾的密碼子(特別是CGA，其相對密碼子使用度分別為2.96和3.32)；盡量避免使用以G結尾的密碼子(除斑石鯛CGG的相對密碼子使用度值為0.86，其余相對密碼子使用度均小于0.5)。

表3 斑石鯛和條石鯛線粒體編碼蛋白基因序列偏好密碼子的相對密碼子使用度

(續表3)

(續表3)

依據密碼子編碼氨基酸原理進行計算，斑石鯛和條石鯛線粒體中的各種氨基酸含量基本一致，含量較高的4種氨基酸依次為亮氨酸>異亮氨酸>丙氨酸>蘇氨酸，其中除異亮氨酸偏好密碼子為AUU，其余3種氨基酸的偏好密碼子也均以AC結尾(圖1)。

圖1 斑石鯛和條石鯛各種氨基酸含量

2.2 因子相關性分析

斑石鯛與條石鯛線粒體編碼蛋白序列因子相關性分析x、y兩軸的分析結果表明，該2種魚線粒體編碼蛋白序列中，AC結尾的密碼子與GU結尾的密碼子明顯分開，距離中心較近的AC結尾與GU結尾密碼子比例相近，但A、C含量相對較高(圖2)，表明該2種魚較偏好使用AC結尾的密碼子。

圖2 斑石鯛和條石鯛線粒體編碼蛋白序列的因子相關性分析

2.3 偏好性密碼子及基因序列的聚類分析

在對基因密碼子使用概率進行聚類分析的過程中，將每個物種的mtDNA編碼蛋白質的基因作為一個對象，將密碼子的相對密碼子使用度作為變量。除去相對密碼子使用度始終為1的編碼色氨酸和甲硫氨酸的密碼子UGG和AUG,再除去3個不編碼氨基酸的終止密碼子，取余下的59個中偏好性密碼子的相對密碼子使用度(大于1)對基因的密碼子使用偏好性進行聚類分析。

聚類結果見圖3，大致分為2類：斑石鯛與條石鯛首先聚類，然后與金鼓魚聚為一類；金鼓魚和黑鯛首先聚為一類，說明它們的密碼子使用的偏好性相似。此外，斑石鯛與金鼓魚幼魚階段形態相似：金鼓魚體黃褐色，體扁、吻短，散布許多黑圓斑，腹部銀白；斑石鯛體色較淡呈灰褐色，各鰭暗色，頭部、體側、胸鰭及各奇鰭基部密布許多黑斑(圖4)。

圖4 斑石鯛和金鼓魚外形

圖3 斑石鯛、條石鯛與其他物種的mtDNA編碼蛋白質的基因密碼子偏好性聚類

將所研究的6個物種的每個mtDNA編碼蛋白質的每個基因(ND1、ND2、COX1、COX2、ATP6、COX3、ND6、ND4、ND5、Cytb)各自看成一類，對每個基因序列進行聚類分析。其結果為斑石鯛和條石鯛均首先聚為一類，它們的距離相對較近；斑石鯛、條石鯛2種魚在ATP6、ND2、COX1、ND5中首先聚類后，其次與金鼓魚聚為一類，這與密碼子偏好性聚類結果一致(圖5)。

圖5 最大似然法對斑石鯛、條石鯛及其他物種mtDNA編碼蛋白基因序列構建的進化樹

3 討 論

3.1 密碼子偏好性分析

基因是生物遺傳信息的載體，蛋白質是發揮生物功能的主要分子。密碼子是聯系兩者的元件，記錄了長期進化過程中物種內在的功能適應性變化，其使用情況必然具有重要的生物學意義。斑石鯛和條石鯛mtDNA編碼蛋白的序列偏好使用以AC結尾的密碼子，最高使用頻率的密碼子是CGA(相對密碼子使用度分別為2.96和3.32)，其次是AAA(1.97和1.89) ，但總體而言以C結尾比A結尾密碼子偏好性略高，這與分析金魚(Carassiusauratus)[19]轉錄組偏好使用GC結尾密碼子分析結果存在差異，說明物種密碼子使用在進化過程中存在保守性，相近物種的密碼子使用偏好性相似，反之則密碼子的使用存在差異。斑石鯛和條石鯛mtDNA以G結尾密碼子避免使用，且與其線粒體COX1、Cyt b和D-loop 3種片段上組成分布一致[18]。以密碼子編碼氨基酸的原理計算，理論上亮氨酸的氨基酸含量最高，且含量較高的亮氨酸(CUA、CUC、CUU)、異亮氨酸 (AUU)、蘇氨酸(ACC、ACA)及丙氨酸(GCC、GCA)4種氨基酸均偏愛相同的密碼子，表明不同氨基酸組成也一定程度影響密碼子使用。

3.2 聚類分析

宋喬喬等[20]對牛亞科動物線粒體基因密碼子偏好性進行聚類分析，發現基于密碼子偏好性差異可以揭示物種間的親緣關系，可用于物種的分類研究。不同物種的密碼子偏好性差異與其親緣關系也密切相關，密碼子偏好性差異小，則親緣關系近；反之，親緣關系遠[21]。Duan等[22]比較了14種鲌亞科魚類密碼子偏好性的差異，發現屬間物種的密碼子偏好性是具有物種特異性，主要是受到進化過程中的突變與自然選擇的影響。基因突變具有低頻性，故近緣物種密碼子在使用偏好性上總體相似，又有輕微差別。在本研究中，密碼子偏好性的聚類分析和基因序列的進化分析結果顯示,密碼子偏好性的聚類分析中斑石鯛和條石鯛聚為一類；基因序列的進化分析結果也顯示，黑鯛與真鯛在ATP6、ND2、Cytb、ND1、ND4、ND5、ND6聚為一類，表明斑石鯛與條石鯛、黑鯛與真鯛親緣關系較近，這與傳統分類學一致。斑石鯛、條石鯛與斑馬魚在基因序列(除ND4)及偏好密碼子聚類中均遺傳距離最遠，說明石鯛科與斑馬魚在進化過程中親緣關系較遠。斑石鯛、條石鯛2種魚在密碼子偏好性聚類中首先聚為一類后，其次與金鼓魚聚為一類；基因序列的分析結果也顯示，在ATP6、ND2、COX1、ND5上存在相同結論，且金鼓魚和斑石鯛在幼魚階段外觀相似，表明石鯛科與金鼓魚親緣關系較近，與傳統分類學存在一定差異。密碼子偏好聚類中，黑鯛與金鼓魚先聚為一類，后與真鯛聚為一類，體現了金鼓魚較真鯛與黑鯛親緣關系更近，這與發育進化樹及傳統分類學[23]存在較大分歧。Christianson[24]認為，基于密碼子的偏好性進行聚類，其結果與真實的系統發育關系不一定完全一致，這一指標在較小的分類單元里比較可靠，但是在分歧較大的分類單元里，這一方法主要還是作為傳統系統樹構建方法的補充和參考。

3.3 研究意義

不同物種密碼子偏好性差異，產生原因可能是各物種生存環境不同，承受壓力不同，導致突變和選擇在物種之間程度有差異[25-26]，此外，基因序列長度[27-28]、編碼區GC含量[29]、翻譯效率[30]和編碼蛋白質的結構與功能[31]等均可引起密碼子使用偏性，至于這些因素具體如何影響同義密碼子偏好性仍有待進一步研究。同時有研究表明，密碼子的使用偏性與基因的表達強弱有關，高效表達的基因所使用的密碼子同低表達的基因相比較，它們具有明顯不同的基因使用頻率，高效表達的基因在密碼子使用上比非高效基因更有偏向性趨勢，它們通常使用一套偏好性同義密碼子，同時發生偏好性使用的密碼子還對應著含量最豐富的tRNA，提高翻譯效率[31-33]。通過優化與改造密碼子，可促進翻譯效率及提高生物中外源基因的表達，如斑石鯛偏好密碼子的基因作為外源基因，可以不經密碼子優化，在條石鯛中獲得高效表達；若依據斑石鯛的密碼子偏好性信息進行密碼子改造，可提高以斑石鯛偏好密碼子的外源基因在其他模式生物中的表達效率。對于今后石鯛科魚類轉基因過程中對構建合適的轉基因表達系統具有重要的指導意義，從而提高特定蛋白的表達量，增強轉基因育種的效果。

同時，研究密碼子偏好性還有很多的意義。研究密碼子使用偏好性有利于改善靶基因在受體表達系統中的表達效果，通過對密碼子進行改造優化已經成為提高外源基因在宿主細胞中的表達效率最有效且成功的途徑之一；通過對密碼子偏好性形成的主要因素探究，對于進一步了解生物基因或基因組特征、分子進化壓力及生態適應等均具有重要啟示；還有許多其他方面的意義，如鑒定基因的表達水平高低，判斷是否發生基因重組，發現新基因等[34-36]。

4 結 論

本研究利用分析密碼子偏好性及聚類分析等生物信息學方法，在mtDNA水平上對斑石鯛和條石鯛編碼蛋白序列的密碼子使用特征進行分析，明確了這2種魚的mtDNA密碼子偏好性，并比較與其他魚類密碼子使用偏好性差異。本研究結果可為探討斑石鯛和條石鯛新基因預測、功能基因組學與其他水生動物在進化中親緣關系等研究提供理論基礎。