甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)代謝及肝毒性研究

蘇美珍，張祎桐，王 浩，呂利群

( 1.上海海洋大學(xué)，國家水生動物病原庫，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306 )

甲苯咪唑(MBZ)屬于苯并咪唑類藥物，又名甲苯達唑、二苯酮咪胺酯、安樂土，其化學(xué)名為(5-苯甲酰基-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸甲酯，是一種廣譜性驅(qū)蟲藥物，可用于防治蛔蟲、絲蟲、鉤蟲、蟯蟲(Enterobiusvermicularis)、鞭蟲(Trichuristrichura)、糞類圓線蟲(Strongyloidesstercoralis)等腸道寄生蟲的疾病[1-3]。

近年來，隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，也帶來了魚類寄生蟲感染病，造成了嚴重經(jīng)濟損失，逐漸引起人們的重視[4]。甲苯咪唑作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)的治療寄生蟲疾病的藥物，其副作用和殘留量較大。口灌的甲苯咪唑主要黏附在腸道部位，吸收后分布在血液、腎臟、肝臟等部位，主要分布在肝胰臟[5]。口服甲苯咪唑也會損傷魚類的生理功能。20多年的臨床試驗發(fā)現(xiàn)，口服甲苯咪唑會帶來一系列的不良反應(yīng)[6-8]。需氧生物在氧化還原中會產(chǎn)生大量的活性氧，而活性氧是自由基的重要組成部分，少量的自由基是必需，但是，自由基過量就會對生物機體造成氧化損傷。生物在生長過程中，體內(nèi)形成了一套完整清理機體內(nèi)過多的自由基的抗氧化系統(tǒng)[9]。其中超氧化物歧化酶是抗氧化酶系統(tǒng)重要成分之一，是一種能反映機體清除自由基能力的酶[10]。過氧化氫酶也是一種抗氧化劑酶，對于防止產(chǎn)生有害的陰離子，在減輕氧化損傷中起到重要的作用。谷胱甘肽過氧化物酶是一種氧自由基捕獲劑。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化氫酶屬于抗氧化劑酶，都是描述藥物綜合毒理學(xué)效應(yīng)的酶類。機體損傷時會破壞抗氧化酶的活性，改變抗氧化酶基因的表達[11]。堿性磷酸酶在生物體解毒過程中起重要的作用；谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶主要存在于心肌細胞和肝臟細胞中，血清中含量很少。但機體發(fā)生損傷時，細胞內(nèi)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶會從細胞中逸出到血液，血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性就會增加[12]。堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶與肝功能有關(guān)，易受環(huán)境的影響，即肝細胞受損時，就會觸發(fā)這些酶的活性。

得益于魚體內(nèi)藥代動力學(xué)研究方法的成熟，制定甲苯咪唑在異育銀鯽各組織中的代謝曲線為其休藥期的制定提供了依據(jù)。但是迄今未見甲苯咪唑在異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)體內(nèi)藥物毒性的研究。我國異育銀鯽的年產(chǎn)量接近2.5×106t，但疾病頻發(fā)，養(yǎng)殖用藥量大且用藥安全風險高，出于合理用藥、安全用藥的需要，筆者比較了甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟的富集水平，研究其最高富集組織中藥物的肝毒性，為甲苯咪唑的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

體表健康的異育銀鯽300尾，體質(zhì)量(90±20) g，購于中國江蘇省烏江縣，暫養(yǎng)于實驗室內(nèi)水族箱，試驗水溫(20±2) ℃，正常供氧，試驗前24 h停止投喂。

99%甲苯咪唑原粉，0.22 μm有機系濾頭，1 mL一次性滅菌注射器，草酸鉀，氯化鈉，DEPC水[生工生物工程(上海)股份有限公司]；99.5%甲苯咪唑標準品(含量 99.5%)(Ehrenstorfer Quality)；甲醇(色譜級)，甲酸(色譜級)，乙腈，水(色譜級),三氯甲烷(中國上海國藥化學(xué)試劑)；CNW 9 mm棕色螺旋口自動進樣瓶，250 μL尖底玻璃內(nèi)插管，9 mm開孔擰蓋(上海安譜實驗科技股份有限公司)；過氧化物歧化酶試劑盒，過氧化氫酶試劑盒，谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒，堿性磷酸酶試劑盒，谷草轉(zhuǎn)氨酶試劑盒，谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒，總蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRlzol(Invitrogen公司)；PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，TB GreenTMPremix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(Takara公司)。

UPLC/MS線性離子阱質(zhì)譜儀(Waters公司)；漩渦混勻器(上海本昂科學(xué)儀器有限公司)；TDL8M臺式大容量冷凍離心機(上海盧湘儀器有限公司)；超純水儀(成都浩純儀器設(shè)備責任有限公司)；超聲波清洗機(上海分析超聲儀有限公司)；低溫保藏箱(Haier公司)；組織勻漿儀(Sigma公司)；電子分析天平(上海海康儀器有限公司)；多功能酶標儀(Promege公司)；CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)。

1.2 甲苯咪唑標準溶液配制及其標準曲線的建立

準確稱取甲苯咪唑10 mg，用88%甲酸溶解于100 mL棕色量瓶中，加入色譜級甲醇到刻度線后充分混勻，配置質(zhì)量濃度為100 μg/mL的甲苯咪唑標準儲備液。將配置好的甲苯咪唑標準儲備液分別稀釋為0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg/mL，然后建立標準曲線。

1.3 色譜條件

樣品分析儀為UPLC/MS線性離子阱質(zhì)譜儀，色譜柱是Hypersil Gold，規(guī)格為100 mm×2.1 mm，1.9 μm，流速0.2 mL/min，進樣量5 μL，柱溫30 ℃，離子源ESI，正離子模式，錐孔電壓30 V，掃描方式多離子監(jiān)測，脫溶劑氣溫150 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h，離子對(定量離子對和定性離子對)m/z為264～296。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序表

1.4 方法

由300尾健康異育銀鯽中隨機選取數(shù)尾。準確稱取100 mg 甲苯咪唑，先用少許的甲酸溶解，再用蒸餾水定容，配制為4 mg/mL。按照20、10、5 mg/kg的藥量用胃管灌胃給藥。在給藥后1、2、4、6、10、24、48、84 h自魚尾靜脈取血。在取出的血中立即加入2%的草酸鉀抗凝劑(抗凝劑∶血漿=1∶10，體積比)混勻，然后以4000 r/min離心10 min；同時迅速取肝胰臟和腎臟樣品。所有樣品放置冰箱-80 ℃冷凍保存。每個時間點取3尾魚，3個平行。

隨機選取數(shù)尾健康異育銀鯽，分為兩組。第一組對照組口灌5%甲酸，第二組試驗組口灌20 mg/kg甲苯咪唑。分別在給藥后的0、24、48 h取肝臟處理測定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶活性和超氧化物歧化酶、過氧化氫酶基因的表達量情況。

甲苯咪唑藥代樣品處理方法參考文獻[13]。將血漿、肝臟、腎臟樣品在室溫下自然解凍，取500 μL血液于2 mL離心管中加入750 μL甲醇，6000 r/min離心5 min，取上清液。重復(fù)2次，合并上清液于1200 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm有機系微孔濾膜，濾液待上機檢測。準確稱取0.2 g的肝胰臟和0.2 g的腎臟于15 mL離心管中，分別加入1 mL的甲醇，用組織勻漿機勻漿，6000 r/min離心10 min，取上清液。重復(fù)2次，合并上清液，分別加入1 mL正己烷，混勻，于12 000 r/min離心10 min，濾液過0.22 μm有機系微孔濾膜，濾液待上機檢測。

魚體超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化氫酶和堿性磷酸酶活力測定：分別取口灌20 mg/kg 甲苯咪唑后0、24、48 h的異育銀鯽肝胰臟于預(yù)冷的0.86%氯化鈉中漂洗，除去血液，濾紙擦干。準確稱取0.2 g肝胰臟樣品放入2 mL離心管中，加入0.86%氯化鈉，用組織勻漿機勻漿(加入生理鹽水的體積總量是樣品質(zhì)量的9倍)制作成10%的組織勻漿，之后于2000 r/min離心10 min。按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說明書測定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化氫酶和堿性磷酸酶的活性。

血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力測定：分別取口灌0、24、48 h后魚的血漿，立即加入2%的草酸鉀抗凝劑(抗凝劑∶血漿=1∶10，體積比)混勻，于1000 r/min離心5 min，取上清液。按照南京建成生物工程研究所試劑盒的說明書方法測定谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性。

肝胰臟中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶基因表達量的測定：分別取口灌0、24、48 h魚的肝胰臟，用Trizol法從肝胰臟中分離總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用實時定量PCR來測定超氧化物歧化酶和過氧化氫酶基因表達量的變化。所用的引物由美國國立生物技術(shù)信息中心上查找異育銀鯽的序列合成，引物序列見表2。采用TBgreen酶。Real time PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，共37個循環(huán)。熔解曲線分析：95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s，溫度由65 ℃升至95 ℃，此過程不斷收集熒光信號，形成熔解曲線。測定口灌0、24、48 h異育銀鯽超氧化物歧化酶和過氧化氫酶兩種基因表達量的變化。

表2 試驗中所用到的引物

1.5 回收率及精密度

回收率：取空白的血清500 μL加入1 mg/mL的甲苯咪唑溶液，取肝胰臟0.2 g，腎臟0.2 g分別加入少許甲醇進行組織勻漿，然后再分別加入1 mg/mL的甲苯咪唑溶液。之后分別稀釋為1.0、0.5、0.1 μg/mL，按照甲苯咪唑樣品預(yù)處理的方法處理，測定回收率。每個質(zhì)量濃度3個平行，取其平均值為實際測定質(zhì)量濃度。

回收率/%=Cr/C0×100%

式中，Cr為空白樣品(血液或者肝腎臟)加入了一定量的甲苯咪唑后測定的試劑質(zhì)量濃度，C0為加入一定量甲苯咪唑已知標準質(zhì)量濃度。

精密度：同一樣品1 d內(nèi)不同時間測3次，連續(xù)測3 d，之后測定血液、肝胰臟、腎臟中甲苯咪唑的日內(nèi)和日間平均變異系數(shù)，來判斷該方法的精密度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

圖表用Excel 2010制作，使用DAS 3.0藥代動力學(xué)軟件、Masslynx V 4.1軟件和SPSS軟件分析處理試驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 甲苯咪唑標準工作曲線

甲苯咪唑標準工作曲線為y=57 387.6x+112 015(r2=0.989903)，在1～50 ng/mL內(nèi)，甲苯咪唑的峰面積與其質(zhì)量濃度呈較好的線性關(guān)系(圖1)。

圖1 甲苯咪唑標準工作曲線

2.2 回收率與精密度

由表3可知，在含有甲苯咪唑標準品1.0、0.5、0.1 μg/mL的組織樣品中，異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟樣品中的回收率分別為79.91%～83.68%、78.23%～89.46%和87.26%～95.94%；其日內(nèi)變異系數(shù)分別為1.16%～8.22%、0.51%～2.83%和1.81%～13.59%；日間變異系數(shù)為1.04%～2.29%、1.98%～7.32%和1.81%～2.96%。表明此方法處理樣品組織，可以得到較高的回收率，重復(fù)性良好。

表3 異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中甲苯咪唑的回收率和變異系數(shù)

2.3 甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)藥代動力學(xué)規(guī)律

分別口灌20、10、5 mg/kg 甲苯咪唑后，異育銀鯽血液、肝胰臟、腎臟中的藥時曲線見圖2～圖4。3種質(zhì)量濃度甲苯咪唑分別在血液、肝胰臟和腎臟中的藥時曲線變化基本一致，均呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢。

由圖2可見，口灌20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑24 h時，異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑含量分別為6.1163、1.1026、0.2005 μg/g；24 h后異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑含量則開始迅速下降。口灌不同劑量后，甲苯咪唑在異育銀鯽組織中含量分布為肝胰臟>腎臟>血液。

圖2 不同劑量下異育銀鯽腎臟中甲苯咪唑的藥—時曲線

由圖3可見，口灌質(zhì)量濃度為20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑24 h時，異育銀鯽血液中甲苯咪唑含量達最大值，分別為0.1837、0.0540、0.0067 μg/mL，0～24 h異育銀鯽血液中甲苯咪唑含量呈上升趨勢，達到最高峰后甲苯咪唑含量則開始下降，在84 h時甲苯咪唑在異育銀鯽血液中幾乎被代謝完全。

圖3 不同劑量下異育銀鯽血液中甲苯咪唑的藥—時曲線

由圖4可見，口灌20、10、5 mg/kg的甲苯咪唑后，肝胰臟中甲苯咪唑含量呈先升后降的趨勢，在24 h時甲苯咪唑含量達最高值，分別為8.2248、3.3963、0.5744 μg/g；24 h后肝胰臟中的甲苯咪唑則被逐漸代謝掉，到84 h時，肝胰臟中的甲苯咪唑含量幾乎被代謝完全。

圖4 不同劑量下異育銀鯽肝胰臟中甲苯咪唑的藥—時曲線

用DAS 3.0藥代動力學(xué)軟件分析藥代數(shù)據(jù)后所得的藥代動力學(xué)參數(shù)見表4。口灌20、10、5 mg/kg甲苯咪唑后，異育銀鯽血液中甲苯咪唑峰質(zhì)量濃度分別為0.1837、0.0540、0.0067 μg/mL，達峰時間均為24 h，藥時曲線下面積(0～t)和藥時曲線下面積(0～∞)分別為6.497 mg/(L·h)和11.815 mg/(L·h)、1.622 mg/(L·h)和1.648 mg/(L·h)、0.274 mg/(L·h)和0.355 mg/(L·h)，消除半衰期分別為51.788、16.312、43.841 h。肝胰臟中甲苯咪唑峰含量分別為8.2248、3.3963 μg/g和0.5744 μg/g，達峰時間均為24 h，藥時曲線下面積(0～t)和藥時曲線下面積(0～∞)分別為271.527 mg/(L·h)和284.857 mg/(L·h)、129.337 mg/(L·h)和131.734 mg/(L·h)、27.994 mg/(L·h)和32.123 mg/(L·h)，消除半衰期分別為21.237、12.575、25.02 h。腎臟中甲苯咪唑峰含量分別為6.1163、1.1026、0.2005 μg/g，達峰時間均為24 h，藥時曲線下面積(0～t)和藥時曲線下面積(0～∞)分別為161.803 mg/(L·h)和162.531 mg/(L·h)、45.705 mg/(L·h)和45.933 mg/(L·h)、7.396 mg/(L·h)和8.117 mg/(L·h)，消除半衰期分別為9.192、9.326 h和34.914 h。

表4 口灌不同劑量甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中的藥代動力學(xué)參數(shù)

2.4 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽肝胰臟相關(guān)酶活性影響

2.4.1 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽肝胰臟中谷胱甘肽過氧化氫酶、堿性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性的影響

異育銀鯽口灌20 mg/kg甲苯咪唑后，肝胰臟中谷胱甘肽過氧化氫酶活性呈時間依賴性下降(圖5a)。肝胰臟中的堿性磷酸酶活性呈先升后降的趨勢(圖5b)。在24 h時堿性磷酸酶活性遠高于0 h時，此時對照組甲酸對肝胰臟中堿性磷酸酶活性的影響也較大；48 h時肝胰臟中堿性磷酸酶活性高于0 h，低于24 h。肝胰臟中過氧化氫酶的活性呈先升后降的變化趨勢，給藥24 h時，過氧化氫酶在肝臟中的活性值最高；48 h時較0 h時有所升高，較24 h下降(圖5c)。給藥后肝胰臟中超氧化物歧化酶活性先升后降，給藥24 h，肝胰臟中超氧化物歧化酶活性達最高值；48 h肝胰臟中超氧化物歧化酶活性較0 h時有所上升，較24 h時有所下降(圖5d)。

圖5 口灌20 mg/kg甲苯咪唑異育銀鯽肝胰臟中谷胱甘肽過氧化物酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的變化

2.4.2 口灌甲苯咪唑后異育銀鯽血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的變化

異育銀鯽口灌20 mg/kg甲苯咪唑后，血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性先升后降，給藥24 h時，血液中的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最高，給藥48 h時，血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性較24 h下降，較0 h上升(圖6)。對照組口灌甲酸后，對血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性影響不大。

圖6 口灌20 mg/kg 甲苯咪唑異育銀鯽肝胰臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化

2.5 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽氧化應(yīng)激超氧化物歧化酶、過氧化氫酶基因表達的影響

口灌20 mg/kg甲苯咪唑后，肝胰臟中超氧化物歧化酶基因的mRNA水平減少，24 h時超氧化物歧化酶基因的mRNA水平最低，甲苯咪唑處理組和甲酸對照組都使超氧化物歧化酶基因表達下調(diào)(圖7a)。給藥后，甲苯咪唑處理組和甲酸對照組都使肝胰臟中的過氧化氫酶基因表達下調(diào)；同樣，在24 h時，過氧化氫酶基因的mRNA水平達最小值(圖7b)。

圖7 口灌20 mg/kg甲苯咪唑后異育銀鯽肝胰臟中超氧化物歧化酶和過氧化氫酶基因mRNA相對表達量變化

3 討 論

3.1 甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的吸收與分布特征

濫用水產(chǎn)藥物可使魚類產(chǎn)生耐藥性或藥物殘留在魚體和人體內(nèi)，很有可能危及人類的健康。所以研究藥物在魚體內(nèi)的代謝及其對魚類的損傷迫在眉睫。不同時間甲苯咪唑在異育銀鯽血液、肝胰臟和腎臟中的分布情況為：在0～24 h之間在體內(nèi)的含量逐步升高，24 h時達到最高峰，24 h后開始下降。這說明口灌24 h內(nèi)，甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)被吸收，24 h后異育銀鯽體內(nèi)的甲苯咪唑不斷發(fā)生代謝。口灌20 mg/kg甲苯咪唑24 h時，血液、肝胰臟和腎臟中的甲苯咪唑含量分別為0.1837、8.2248、6.1163 μg/g，84 h時分別為0.0013、0.4317、0.0623 μg/g。可以看出，在84 h時甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)已基本代謝完。這一代謝規(guī)律與文獻[14-15]的論述類似：甲苯咪唑在團頭魴(Megalobramaamblycephala)體內(nèi)主要代謝物及其變化規(guī)律，在給藥24 h，體內(nèi)的甲苯咪唑含量也不斷增高，在24 h含量達到峰值；在復(fù)方甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的藥物動力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，前期復(fù)方甲苯咪唑在體內(nèi)快速吸收達到峰值后，藥物開始在體內(nèi)代謝；在96 h時復(fù)方甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)幾乎被代謝完全。

本試驗中，給藥24 h時，魚體各組織中甲苯咪唑達到峰值的順序為：肝胰臟>腎臟>血液，肝臟中的甲苯咪唑吸收最快，分布最多，而血液中甲苯咪唑的含量低于肝胰臟和腎臟。這可能是因為肝胰臟是主要的解毒器官，相比其他組織吸收更快；其次可能是因為甲苯咪唑溶解度低，在腸壁和肝臟中存在著首過效應(yīng)[13]，所以大部分藥物主要存在于肝胰臟或者腎臟中，所以推測甲苯咪唑的吸收和分布情況可能與藥物的理化性質(zhì)和魚體組織器官有關(guān)[16]。此次對甲苯咪唑在異育銀鯽體內(nèi)的藥代研究也給有關(guān)部門制定甲苯咪唑最高殘留量以及休藥期提供了參考。

3.2 甲苯咪唑?qū)Ξ愑y鯽的肝毒性分析

正常情況下，動物體內(nèi)的氧化—抗氧化系統(tǒng)呈穩(wěn)定狀態(tài)，但當外界有毒物質(zhì)進入機體后，破壞動物體內(nèi)的氧化—抗氧化系統(tǒng)，產(chǎn)生過多的自由基，機體內(nèi)有關(guān)酶性和非酶性抗氧化系統(tǒng)就會清除過多的自由基[17]。超氧化物歧化酶和過氧化氫酶是生物體內(nèi)重要的抗氧化物酶，是抵御氧化應(yīng)激的第一道防線。超氧化物歧化酶是保護酶系統(tǒng)的重要組成部分[18]，它的作用原理是催化超氧化物自由基成為過氧化氫，再在過氧化氫酶的作用下將過氧化氫還原為水。由圖5c、d可知，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性呈先升后降的變化趨勢，在24 h時，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性達最高值。這可能是由于肝臟是機體內(nèi)的主要解毒器官，甲苯咪唑含量也最高，所以產(chǎn)生的活性氧較多所致。此時的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，清除體內(nèi)過多的自由基。在48 h時機體內(nèi)的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性相對于24 h而言酶活性被抑制，這可能與過量的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[19]。過氧化氫酶的活性降低也可能是因為超氧化物歧化酶活性降低導(dǎo)致的過氧自由基過多[20]。有研究報道，過多的超氧陰離子可以抑制過氧化氫酶的活性[21]。

谷胱甘肽過氧化物酶也是機體內(nèi)重要的抗氧化劑，能清除機體中的過氧化氫和細胞膜中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)、功能完整、增強機體免疫和抗病的作用[22-23]。由圖5a可知，谷胱甘肽過氧化物酶的活性呈下降趨勢。這可能是因為谷胱甘肽過氧化物酶在解毒的過程中活性受到了抑制。由圖7a、b可見，口灌20 mg/kg甲苯咪唑后，超氧化物歧化酶基因的mRNA水平呈先下降后上升的趨勢，這可能是因為肝臟中的谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性增加。Jin等[24]將小鼠長期暴露于Pb中，小鼠的谷胱甘肽過氧化物酶發(fā)生劑量依賴性降低，與本試驗的結(jié)果類似。堿性磷酸酶是機體在代謝或抗氧化過程中關(guān)鍵酶，是磷代謝重要酶類之一，主要存在于骨骼、肝臟等地方，與生物體的成長密切相連[25-26]。由圖5b可知，肝胰臟中堿性磷酸酶的活性呈先升后降的變化趨勢。在24 h時堿性磷酸酶活性達最高值，在48 h時堿性磷酸酶活性相較24 h時下降，這提示了肝胰臟中的堿性磷酸酶活性受甲苯咪唑的含量和給藥的時間影響。先升后降的趨勢是動物對毒物的反應(yīng)形式，即拋物線形式；拋物線頂點是動物對毒物的最大反應(yīng)值[27]。在24 h時，異育銀鯽肝胰臟中的甲苯咪唑含量最高，這使得24 h堿性磷酸酶的活性相較于0、48 h而言最高。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是動物體內(nèi)重要的氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，其活性變化也反映肝細胞受損的情況。谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于細胞漿中，谷草轉(zhuǎn)氨酶則主要存在于線粒體中[28-29]，在血清中的含量很少，當肝臟受損時，細胞漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶就會釋放到血液中，血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性增加[12]。由圖6a、6b可知，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的變化趨勢是先升后降。在24 h時血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性最高，這可能是因為在24 h時，肝臟中的甲苯咪唑含量最高，肝細胞受損比較嚴重，細胞漿中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液中，使血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性升高。這與盧敬讓等[30]的研究結(jié)果類似。在48 h時谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性相較24 h時下降，較0 h時上升。這可能是因為48 h時肝胰臟中的甲苯咪唑被代謝掉，毒性相較24 h時降低了，所以此時血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性低于24 h時，但要高于0 h時。本試驗結(jié)果提示，不應(yīng)長期使用甲苯咪唑防控寄生蟲，需要在藥物使用后進行藥物保肝處理；在肝膽綜合征和鯽皰疹病毒并發(fā)期應(yīng)慎用甲苯咪唑。