中華絨螯蟹生殖蛻殼后卵巢發育規律的研究

葛永春，吳旭干

( 1.上海海洋大學，農業部淡水種質資源重點實驗室，上海 201306； 2.上海登瀛水產養殖專業合作社，上海 202164； 3.上海海洋大學，水產動物遺傳育種上海市協同創新中心，上海 201306； 4.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306 )

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是我國最重要的養殖蟹類，2017年全國成蟹養殖產量為7.509×105t[1]，產值500多億元。性腺作為中華絨螯蟹的主要可食部位之一，其發育的優劣直接關系到中華絨螯蟹的食用價值和經濟價值[2-3]。由于雌蟹的性腺指數遠高于雄蟹，且雌蟹性腺(卵巢)中富含n-3高度不飽和脂肪酸、必需氨基酸和維生素等營養物質，因此卵巢發育良好的雌蟹(紅膏蟹)市場價格較高[2-4]。此外，我國中華絨螯蟹養殖苗種主要依靠挑選池塘養殖親本進行人工繁殖，所以中華絨螯蟹的卵巢發育情況直接關系到后續的交配繁殖[4-5]。

生殖蛻殼是短尾派蟹類自亞成體向成體過渡的一次關鍵蛻殼，中華絨螯蟹卵巢通常在生殖蛻殼后快速發育[3,6-7]。但是，蟹類蛻殼期間及剛蛻殼后非常脆弱，極易遭受敵害生物和同類的侵襲而死亡[8]。此外，池塘養殖過程中通常在中華絨螯蟹卵巢發育的后期投喂優質餌料進行育肥，以促進卵巢發育和提高營養價值[2,9]。因此查明中華絨螯蟹生殖蛻殼后的成活率和卵巢發育規律不僅對其在實際生產中的養殖管理有一定的現實意義，而且可以為學者們在科研工作中選擇不同卵巢發育階段的中華絨螯蟹雌體提供一定的基礎資料。鑒于此，筆者以生殖蛻殼前雌蟹為對象，研究其在群體養殖條件下生殖蛻殼后的成活率、質量增加率和卵巢發育規律的變化，以進一步為中華絨螯蟹養殖管理、育肥和捕撈上市等提供基礎資料和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 試驗蟹及試驗設計

試驗蟹于2018年8月初取自上海崇明東風試驗基地的室外養殖池塘。試驗初期選取肢體健全、活力好且均處于生殖蛻殼前的雌蟹80只，體質量為50～70 g，放入室內2.5 m×3.75 m×1.0 m聚乙烯水桶中，暫養一周后開始正式試驗。

試驗共設計3個水桶，每個水桶內隨機放入15只中華絨螯蟹，3個水桶隨機標記為1#、2#、3#，并對每個桶內的中華絨螯蟹進行稱量質量和標記，用油漆筆在蟹殼上標記為1#-1～1#-15，以此類推，以便于后續的觀察。試驗過程中，每日檢查和記錄死亡個體的數量、完成生殖蛻殼個體的數量和蛻殼時間。當發現中華絨螯蟹生殖蛻殼后的殼硬化后，取出稱量質量并記錄。為研究中華絨螯蟹生殖蛻殼后的卵巢發育規律，取生殖蛻殼后的30只雌體繼續養殖60 d，每5～10 d解剖1次。具體的采樣時間為6次：雌蟹生殖蛻殼后1～10 d、11～20 d、21～30 d、31～40 d、41～50 d、51～60 d。每個采樣時間均隨機解剖3只，記錄其卵巢質量和體質量，同時取少量卵巢組織固定于波恩氏液中，以研究其生殖蛻殼后的卵巢發育情況。試驗期間，每個養殖水桶中均放有聚氯乙烯板和水草等遮蔽物供蟹隱藏。

1.2 養殖管理

試驗期間，每日18:00投喂配合飼料，投喂量為蟹體質量的1%～3%，次日8:00清除殘餌和糞便，并根據殘餌、水溫和攝食情況適當調整投餌量。每隔8 h觀察并記錄中華絨螯蟹蛻殼和死亡情況，以便于統計蛻殼時間和成活率。一旦發現中華絨螯蟹蛻殼，立即將其放入單養塑料盒中，待蟹殼硬化后再用記號筆標注放入原先的養殖水槽中繼續養殖。采用循環水工藝對養殖用水進行凈化處理，定期采用曝氣后的自來水來補充蒸發掉的水分。試驗期間，24 h連續充氧，自然光照，試驗期間自然水溫19.2～28.5 ℃。養殖水體pH 7.0～8.5，溶解氧>4 mg/L，氨氮<0.5 mg/L，亞硝態氮<0.15 mg/L。

1.3 數據采集

1.3.1 質量增加率和死亡率

試驗過程中，每日檢查和記錄完成生殖蛻殼和死亡個體的數量，當發現中華絨螯蟹生殖蛻殼后的殼硬化后取出稱量質量，稱量前用干毛巾拭去體表水分，電子天平稱量(精確至0.01 g)，測量完成后放回原處繼續養殖。根據下式計算生殖蛻殼后的成活率和質量增加率：

成活率/%=(n1/n)×100%

質量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

式中，n為蟹總數量，n1為生殖蛻殼后的存活數量，m1為生殖蛻殼前的體質量，m2為生殖蛻殼后體質量。

1.3.2 卵巢指數和組織學

試驗過程中，根據中華絨螯蟹完成生殖蛻殼的時間，每5～10 d解剖1次。解剖后取出每只蟹的全部卵巢，電子天平稱量質量(精確至0.01 g)后計算卵巢指數。

卵巢指數/%=m3/m×100%

式中，m為蟹體質量，m3為卵巢質量。

對波恩氏液固定的卵巢組織進行常規石蠟切片，切片厚度5.0～7.0 μm，蘇木精—伊紅染色后中性樹膠封片，隨后在顯微鏡下進行觀察(Leica DM2500，德國徠卡公司)，并采用自動數碼攝像系統(Leica DFC295)進行拍照和圖片處理。參考文獻[10-11]的分期方法將中華絨螯蟹卵巢進行分期，并在顯微鏡下統計切片上15～20個卵細胞的卵徑。各期的組織學特征為：Ⅰ期，卵巢內的主要細胞類型卵原細胞和卵黃合成前卵母細胞，細胞質呈嗜堿性；Ⅱ期，卵巢內可見大量橢圓形的內源性卵黃合成期卵母細胞(EN)，細胞質呈嗜堿性；Ⅲ期，卵巢內主要細胞類型是外源性卵黃合成期卵母細胞(EX)，胞質嗜堿性減弱并向嗜酸性轉變；Ⅳ期，卵巢內為不規則的近成熟期卵母細胞(NO)，胞質呈嗜酸性，且胞質內含有大顆粒卵黃物質；Ⅴ期，卵巢內為成熟卵母細胞(MO)，卵黃顆粒較大且較均勻分布在整個細胞內。

1.4 數據處理

所有數據采用平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行統計分析, 用Levene法進行方差齊性檢驗，當數據不滿足齊性方差時對百分比數據進行反正弦或者平方根處理，對試驗結果進行單因子方差分析, 采用Tukey s-b(K)法進行多重比較；當數據轉換后仍不滿足齊性方差時，采用Games-Howell非參數檢驗進行多重比較。P<0.05為差異顯著, 在Excel軟件上繪制相關圖表。

2 結 果

2.1 雌體生殖蛻殼后的質量增加率和成活率的變化

對雌體生殖蛻殼后的質量增加率和成活率進行統計發現，在本試驗條件下生殖蛻殼后雌體的平均質量增加率為(54.60±4.93)%；而平均成活率為(71.11±3.85)%。

2.2 雌體生殖蛻殼后的卵巢指數和卵徑的變化

中華絨螯蟹雌體在生殖蛻殼后20 d內卵巢發育較為緩慢(圖1)。其中在中華絨螯蟹生殖蛻殼后10 d，雌體的平均卵巢指數為(0.45±0.02)%，而生殖蛻殼后20 d的雌體平均卵巢指數為(1.48±0.05)%。隨著養殖的進行，卵巢發育進入快速階段，生殖蛻殼后30 d雌體的平均卵巢指數為(2.05±0.21)%，至生殖蛻殼后40 d，雌體平均卵巢指數已顯著增至(2.53±0.72)%。隨著卵巢的進一步發育，待生殖蛻殼后50 d，雌體的平均卵巢指數已為(6.83±0.51)%。至生殖蛻殼后60 d，雌體卵巢指數進一步增至(7.43±0.23)%。統計分析發現，中華絨螯蟹雌體的卵巢指數和生殖蛻殼后的時間呈顯著正相關(P<0.05,n=19)。兩者之間為冪函數關系(y=0.3448e0.0565x,r2=0.90)。就卵母細胞長徑而言，中華絨螯蟹卵母細胞長徑與其生殖蛻殼后的時間亦呈顯著正相關，待生殖蛻殼后60 d時, 雌體卵母細胞的長徑可高達280 μm，兩者之間為冪函數關系(y=29.328e0.0424x,r2=0.78)(圖2)。

圖2 群體養殖中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后卵母細胞長徑的變化

2.3 雌體生殖蛻殼后的卵巢組織學變化

組織學觀察發現，中華絨螯蟹生殖蛻殼后10 d的卵巢處于卵巢發育的Ⅱ期早期，卵巢中的細胞類型為卵黃合成前卵母細胞(PRO)和內源性卵黃合成期卵母細胞(EN)(圖3a)。生殖蛻殼后20 d的雌體卵巢亦處于卵巢發育的Ⅱ期，但卵巢中的主要細胞類型已轉變為內源性卵黃合成期卵母細胞(圖3b)。隨后，卵巢進入快速發育時期，生殖蛻殼后30 d雌體的卵巢發育至Ⅲ期，卵巢中的主要細胞類型為外源性卵黃合成期卵母細胞(EX)(圖3c)。至生殖蛻殼后40 d的卵巢中的細胞類型仍為外源性卵黃合成期卵母細胞(圖3d)。待生殖蛻殼后50 d，雌體的卵巢已經發育至Ⅳ期，卵巢中的細胞類型為近成熟期卵母細胞(NO)(圖3e)。至生殖蛻殼后60 d，可觀察到近成熟期卵母細胞內的卵黃物質進一步均質化(圖3f)。

圖3 群體養殖中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后卵巢組織學的變化

3 討 論

3.1 雌體生殖蛻殼后的質量增加率和成活率的變化

甲殼動物的生長是通過周期性的蛻殼來實現的，而生殖蛻殼是蟹類由亞成體到成體階段的最后一次蛻殼[3,6-7]。本研究結果表明，室內聚乙烯桶養雌體生殖蛻殼后的平均成活率為71.11%，其高于土池養殖中華絨螯蟹[12]生殖蛻殼后成活率(59.2%)。此外，本試驗中每隔8 h觀察一次，發現中華絨螯蟹蛻殼后立即將其保護起來，也保證了中華絨螯蟹生殖蛻殼后的成活率。本試驗中中華絨螯蟹生殖蛻殼后的平均質量增加率為54.60%，這與土池養殖中華絨螯蟹[12]的質量增加率接近。

3.2 雌體生殖蛻殼后的卵巢指數和卵徑、卵巢組織學的變化

甲殼動物的卵巢發育過程非常復雜，其受到溫度、鹽度、光照周期和餌料等多種因素的綜合調控[13-14]。一般認為生殖蛻殼是蟹類卵巢發育的起點，生殖蛻殼后蟹類卵巢開始快速發育[12,15-16]。本試驗結果表明，中華絨螯蟹雌體在生殖蛻殼后20 d內卵巢內的卵母細胞類型主要為內源性卵黃合成期卵母細胞，且卵巢指數增長緩慢，這可能是因為：(1)中華絨螯蟹雌體剛剛生殖蛻殼后，需要完成從內源性卵黃合成期到外源性卵黃合成期的轉變，濾泡細胞遷移到卵母細胞四周需要一個過程[11]；(2)剛剛生殖蛻殼后的中華絨螯蟹雌體需要優先在肌肉和肝胰腺中積累較多的營養物質，才能保證其后續正常卵巢發育[17]。隨著養殖的進行，卵巢發育進入快速階段，卵母細胞由內源性卵黃合成期卵母細胞發育為近成熟期卵母細胞，且卵巢指數急劇增加。

綜上，本試驗進一步探明了中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后的卵巢發育規律，這為中華絨螯蟹養殖管理、育肥和捕撈上市等提供基礎資料和實踐依據。中華絨螯蟹生殖蛻殼后20 d內卵巢發育較為緩慢，隨后進入快速發育階段，因此在今后的中華絨螯蟹養殖管理中，在中華絨螯蟹生殖蛻殼后的一段時間內應投喂足量的餌料以滿足中華絨螯蟹后續的卵巢發育需求。此外，筆者通過規律間斷采樣探明中華絨螯蟹雌體生殖蛻殼后的卵巢發育規律，為今后科研工作中選擇不同卵巢發育階段的中華絨螯蟹雌體提供了參考資料。

4 結 論

將體質量為50～70 g的中華絨螯蟹雌蟹亞成體在室內放置遮蔽物的聚乙烯水桶中養殖至生殖蛻殼后，取出30只雌體繼續養殖60 d發現，卵巢指數和生殖蛻殼后的時間呈顯著正相關，兩者之間為冪函數關系(y=0.3448e0.0565x,r2=0.90)，卵母細胞長徑與其生殖蛻殼后的時間亦呈顯著正相關，兩者之間為冪函數關系(y=29.328e0.0424x,r2=0.78)。