LncRNA-XIST/miR-137/Notch1在糖尿病視網膜病變患者血清和玻璃體中的表達及機制

許瑤 婁靜 趙峰

1蘇州大學附屬第一醫院眼科（江蘇蘇州215000）；2蘇州市獨墅湖醫院眼科（江蘇蘇州215000）；3中山大學中山眼科中心（廣州510060）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的一種血管并發癥，糖尿病通過破壞包含血視網膜屏障（BRB）的內皮細胞（endothelial cells，ECs）之間的緊密連接，導致視網膜血管重塑異常新生血管形成［1］。研究表明，高血糖可促進血管內皮細胞的增殖和遷移，加速血管內皮細胞的形成［2］。因此，調節ECs 功能可能為DR 的治療提供一種新的治療策略。

在DR 病變中，NOTCH1 信號紊亂導致血視網膜屏障被破壞，因此，NOTCH1 在維持健康視網膜屏障功能中的重要作用［3］。有研究表明miR-137啟動子甲基化在DR 的發生發展中也起到了重要作用［4］。抑制miR-137 基因表達可減弱高糖誘導的內皮細胞增殖抑制和凋亡促進作用［5］。研究表明長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNAs）與2 型糖尿病及其相關的腎和視網膜并發癥相關［6-7］。也有研究表明在糖尿病和糖尿病相關微血管并發癥中lncRNAs 存在異常表達［8-9］。長鏈非編碼RNA XIST（lncRNA-XIST）是位于X 染色體失活中心的基因的轉錄產物，研究發現其表達失調會與多種疾病的發生密切相關［10］，但在DR 中的研究尚無報道，這也是本研究的重要目的。

本文通過研究lncRNA-XIST/miR-137/Notch1在糖尿病視網膜病變患者血清和玻璃體中的表達。探討lncRNA-XIST 可能在調節全身葡萄糖穩態和DR 發展中發揮重要作用及其可能的機制，為DR 的治療提供一種新的診療策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料本文收集了我院糖尿病視網膜病變患者（n=12），作為試驗組。對照組分為正常玻璃體對照組（n= 12）和正常血清對照組（n= 12）。本研究經蘇州大學附屬第一醫院倫理審查委員會批準，并簽署知情同意書。

1.2 細胞培養和轉染人視網膜微血管內皮細胞（Human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）購于American Type Culture Collection（ATCC），HRMECs 在內皮細胞培養基（Endothelial medium，ECM）中與5%胎牛血清、1%內皮細胞生長補充劑和1%青霉素/鏈霉素溶液在37 ℃和5%CO2下培養。lncRNA-XIST、silncRNA-XIST、miR-137、silncRNA-XIST 和negative 使 用Lipofectamine 3000 轉染HRMECs。轉染48 h 后，用30 mmol/L 葡萄糖作為高糖模型，備用。

1.3 RNA 提取與qRT-PCR總RNA 用lncRNA和miRNeasy 小試劑盒（中國北京天根生物科技公司）提取。用cDNA 合成試劑盒（中國北京天根生物科技公司）反向轉錄，用帶有gDNA 橡皮擦的PrimeScript RT 試劑盒（Takara，Kusatsu，Japan）反向轉錄RNA，并用TB-Green 預混物Ex-Taq-II（Takara）進行擴增。分別用U6（天根生物科技）為lncRNA和miRNeasy 的內對照。PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環后72 ℃充分延伸10 min，用2-△△Ct法分析定量結果。實驗中lncRNA-XIST 上游引物為“CGGGTCT CTTCAAGGACATTTAGCC”，下游引物為“GCACCAATACA GAGGAATGGAGGG”；miR-137 上游引物為“GAA ATC CGA CAG CTT AAG GAG GTT TGA”，下游引物為“CAT TGC ACA GAT AGG ATT TGA TTT ACT”。

1.4 Western blot試驗組、正常玻璃體對照組和正常血清對照組三組中樣品用蛋白質提取試劑盒（Qiagen）提取蛋白質后BCA 法檢測蛋白濃度。上樣后進行SDS-PAGE 電泳，120 V 電泳1 h，電泳結束后將目的蛋白轉移到PVDF 膜（100 V 1 h），封閉液中室溫孵育1 h。使用主要抗體包括多克隆anti-Notch1 抗體（1 000∶1）和anti-GAPDH 抗體（1 000∶1）在4 ℃條件下孵育過夜后，TBST 洗膜3 次，使用抗兔二抗IgG 在37 ℃條件下孵育2 h。用ECL 增強化學熒光試劑（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）和ChemiDoc XRS 系統（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）觀察表達，Image J 圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

1.5 細胞增殖實驗驗和ELISA 實驗細胞計數試劑盒-8（CCK-8）用于檢測細胞增殖。分別被lncRNA-XIST、silncRNA-XIST、miR-137、silncRNAXIST 和negative 轉染后的HRMECs 細胞按照1 ×105個/mL 鋪在96 孔板上，待每孔細胞密度生長至70% ～80%后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液。37 ℃孵育4 h 后，在450 nm 處測定吸光度值。按照ELISA 試劑盒的使用步驟檢測ROS、GSH、GSH-px、SOD 和MDA 水平，在450 nm 處測定吸光度值。ROS 染色用DM5000B顯微鏡（Leica biosystems，Wetzlar，德國）觀察細胞。

1.6 熒光素酶報告分析法將含有野生型或突變型miR-20b-5p 結合位點的BAMBI 序列3′UTR 插入pmiR-RB 報告載體（ribbio）的XhoI 和NotI 限制位點。將含有野生型或突變型miR-20b-5p 結合位點的circDNMT3B 序列插入psi-CHECK2 載體（Geneseed）的SgfI 和NotI 限制位點。pmiR-RB 報告和psiCHECK2 向量的地圖如補充圖S1 所示。使用Lipofectamine 3000（生命技術）將熒光素酶報告載體與miR-20b-5p 模擬物或miR 模擬物NC 共轉染293T 細胞。轉染后48 h，根據制造商的說明，使用Synergy H4 多模式閱讀器（BioTek，Winooski，VT，USA）使用雙熒光素酶報告分析系統（Promega，Madison，WI，USA）檢測熒光素酶活性。miRNA 在RNA 序列上的結合導致腎素熒光素酶（Rluc）表達降低，影響熒光素酶活性。

1.7 統計學方法使用GraphPad Prism 軟件7.0 版進行統計分析。數據用平均值±標準差表示。采用t檢驗比較兩組間的統計學差異。采用單因素方差分析和Bonferroni 多重比較進行多重比較。P ＜0.05 為差異具有統計學意義。每個分析至少進行3 個獨立實驗。

2 結果

2.1 lncRNA-XIST/miR-137 在糖尿病視網膜病變患者血清和玻璃體中的表達在糖尿病視網膜病變患者中，血清和玻璃體中lncRNA-XIST的表達量明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1A、1B）。同時，在糖尿病視網膜病變患者中，血清和玻璃體中miR-137 的表達水平均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1C、1D）。

圖1 lncRNA-XIST/miR-137 在糖尿病視網膜病變患者血清和玻璃體中的表達Fig.1 Expression of lncRNA-XIST/miR-137 in serum and vitreous of patients with diabetic retinopathy

2.2 lncRNA-XIST 通過ROS 水平調控視網膜細胞增殖見圖2A，lncRNA-XIST 質粒提高視網膜細胞中lncRNA-XIST 的表達水平，差異均有統計學意義（P＜0.05）。lncRNA-XIST 表達的提高能夠促進視網膜細胞增殖，減少ROS 和MDA 的水平，增加GSH、GSH-PX 和SOD 水平，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1B-G）。silncRNA-XIST 抑制視網膜細胞中lncRNA-XIST 表達水平，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2H。下調lncRNAXIST 發現，視網膜細胞增殖被抑制，ROS 和MDA的表達水平提高，GSH、GSH-PX 和SOD 的表達水平受到抑制，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖1I-N）。

2.3 miR-137 是lncRNA-XIST 重要靶點見圖3A，miR-137 與lncRNA-XIST 結合位點。miR-137+lncRNA-XIST 減少熒光素酶表達量，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖3B）。提高lncRNA-XIST 表達水平抑制了視網膜細胞的miR-137 表達量，下調lncRNA-XIST 后下調視網膜細胞中miR-137 的表達水平明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖3C、D）。

2.4 miR-137 通過ROS 水平調控視網膜細胞增殖見圖4A，miR-137 質粒激活視網膜細胞中miR-137 表達量，差異均有統計學意義（P＜0.05）。上調miR-137 抑制視網膜細胞的增殖，提高了ROS 和MDA 的水平，減少GSH、GSH-PX 和SOD 水平，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖4B、G）。見圖4H，si-miR-137 中miR-137 的表達量顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。si-miR-137 組中，視網膜細胞增殖能力得到增強，ROS 和MDA 的水平受到抑制，GSH、GSH-PX 和SOD 水平也被激活，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖4I、N）。

2.5 Notch1 是miR-137 重要靶點見圖5A，Notch1 與miR-137結合位點。miR-137+ Notch1 減少熒光素酶表達量，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖5B）。激活lncRNA-XIST 提高了視網膜細胞的Notch1 蛋白表達水平，下調lncRNA-XIST 降低了視網膜細胞的Notch1 蛋白表達量，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖5C、D）。同時，上調miR-137 抑制視網膜細胞的Notch1 蛋白表達量，下調miR-137 后視網膜細胞的Notch1 蛋白表達量得到提高，差異均有統計學意義（P＜0.05，圖5E、F）。

圖2 LncRNA-XIST 通過ROS 水平調控視網膜細胞增殖Fig.2 LncRNA-XIST regulates retinal cell proliferation through ROS levels

圖3 miR-137 是LncRNA-XIST 重要靶點Fig.3 miR-137 is an important target of LncRNA-XIST

3 討論

糖尿病視網膜病變主要由長期有害的高糖暴露引起，導致血管通透性增加、血管管破壞和血-視網膜屏障（BRB）破裂［11］。ECs 具有緊密的連接是維持內部BRB 的必要條件，其損傷導致血管通透性增加［12］。本研究DR 患者中，lncRNAXIST 表達被抑制，miR-137 表達被激活。激活lncRNA-XIST 能夠促進視網膜細胞增殖，減少了ROS 和MDA 的水平，增加GSH、GSH-PX 和SOD 水平。表明，lncRNA-XIST 可以調控ROS 誘導DR 氧化應激損傷。

圖4 miR-137 通過ROS 水平調控視網膜細胞增殖Fig.4 miR-137 regulates retinal cell proliferation by ROS levels

圖5 Notch1 是miR-137 重要靶點Fig.5 Notch1 is the important target of miR-137

研究表明lncRNA-MEG3 的高表達可通過抑制TGF-β1 和VEGF 的表達而抑制糖尿病視網膜病變的發展［13］。也有研究表明lncRNA HOTTIP 通過p38 MAPK 途徑改善糖尿病視網膜微血管病變，LncRNA HOTTIP 有望成為治療糖尿病微血管病變的新靶點［14-15］。本研究中提高lncRNA-XIST 表達水平抑制了視網膜細胞的miR-137 表達量，下調lncRNA-XIST 后下調視網膜細胞中miR-137 的表達水平明顯升高，提示miR-137 是lncRNA-XIST 調控DR 的重要靶點。這與已有研究中在糖尿病條件下，下調的長非編碼核旁蛋白組裝轉錄本1 通過升高miR-497 降低腦源性神經營養因子的表達，從而促進Müller 細胞凋亡，加重糖尿病視網膜病變的結果相似［16］。

研究發現miR-137 過表達可使ECs 增殖活性顯著降低，高糖環境下增殖活性進一步降低，說明miR-137 過表達可調節ECs 的生物學功能，降低增殖活性和遷移能力［17-18］。本次研究表明，激活miR-137 能夠抑制視網膜細胞增殖，提高了ROS和MDA 的水平，減少GSH、GSH-PX 和SOD 水平。這顯示，lncRNA-XIST/miR-137 可能調控DR 疾病中ROS 誘導的氧化應激損傷。抑制Notch1 信號觸發細胞產生ROS，導致最后細胞死亡，進一步損害組織活動［19-20］。研究發現Notch1 能夠通抑制ROS水平，減少視網膜內皮細胞死亡，可保護DR［21］。本研究發現激活lncRNA-XIST 能夠激活視網膜細胞的Notch1 蛋白表達量。說明，LncRNA-XIST/miR-137/Notch1 在DR 病變患者血清和玻璃體中發揮著重要作用。

總之，本研究首次發現lncRNA-XIST/miR-137/Notch1 可能通過ROS 水平及其氧化應激來參與糖尿病視網膜病變，具有潛在治療和診斷靶點，為以后的相關研究提供實驗依據。然而本研究中的獲取的樣本量較少，后續研究中，筆者嘗試對LncRNA-XIST/miR-137/Notch1 參與糖尿病視網膜病變做深入探究，了解LncRNA-XIST/miR-137對糖尿病視網膜病變的調控是否涉及其他通路。