糖基化修飾對核桃谷蛋白結構和功能特性的影響

張玥，薛雨菲，李芳，楊罡，戴志偉，劉偉，孔令明*，孫乾

1(新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊，830052)2(新疆輕工職業技術學院，新疆 烏魯木齊，830021)3(福建農林大學 食品科學學院，福建農林大學中愛食品材料科學與結構設計國際合作中心，福建 福州，350002)

核桃是果木兼用樹種，有著豐富的營養價值。中國核桃產量居世界首位，使得核桃成為開發功能性食品的優質原料。目前，核桃榨油后得到的副產物核桃餅粕的綜合利用率低，或用作肥料、飼料。核桃中蛋白質含量為18%～25%，其中谷蛋白占總蛋白的70%以上。谷蛋白為水不溶性蛋白質，且雙親性較差，因此，為有效利用核桃蛋白，擴大其在食品加工及其他領域的應用，從核桃餅粕中提取蛋白質并綜合性利用加工成為核桃蛋白高值化應用的主要加工方向。

糖基化(glycosylation)作為一種常用的、簡潔有效的蛋白質修飾方法，能高效地修飾蛋白質特性。糖基化反應的本質是美拉德(Maillard)反應中Amadori重排，即蛋白分子中的賴氨酸殘基與糖分子中的羥基共價鍵結合形成糖-蛋白類物質。在蛋白質分子中的氨基酸側鏈上引入糖類物質的基團，生成的蛋白-糖類物質能夠在特定環境中阻礙蛋白分子相互聚集，提高蛋白質的功能特性[1]。糖基化改性相比其他改性方法，因其快速化、強烈化、顯著化和高效化等特點，而逐漸成為現代食品加工領域熱點的研究方向之一。

目前，糖基化改性的研究多集中在大豆、花生、大米、乳清分離蛋白、酪蛋白等[2]，較為詳盡地闡述了影響改性蛋白的眾多因素，如溫度、時間和pH等。而且大量的研究也表明了糖基化的改性具有良好的效果，有研究表明[3]糖基化改性后大豆分離蛋白和葡萄糖復合物的溶解度、乳化特性均有顯著提高；即使在蛋白的等電點處，經改性后的糖-蛋白復合物也具有良好的溶解性[4]；DECOURCELLE等[5]研究魚蝦蛋白與糖的反應，得到糖-蛋白復合物的溶解性也有顯著提高；有研究[6]稱，酪蛋白與糖反應，改善了糖-蛋白共價復合物的乳化效果，復合產物擁有了更優良的功能特性；還有研究[7]稱，在糖基化改性中，選擇多糖比單糖與雙糖的效果更好，更有助于蛋白功能特性的提升。

實驗選用葡萄糖、乳糖和葡聚糖修飾核桃谷蛋白，以接枝度、褐變度、溶解度、乳化特性、起泡特性等指標為依據，并結合光譜圖分析核桃谷蛋白改性前后功能特性以及蛋白分子結構表征的變化，為核桃蛋白的綜合性利用、產業化生產和高質化精深加工提供理論參考，以期為核桃產業的深加工以及食品工業生產提供有利的支撐和保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃餅粕(冷榨后含蛋白質質量分數為66.29%)，新疆中亞食品有限公司；核桃谷蛋白(walnut glutenin，WG，純度為80.26%)，實驗室自制；葡萄糖、乳糖，天津市凱通化學試劑有限公司；葡聚糖，Admas Reagent Co., Ltd.；鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA )，上海高鳴化工有限公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、Ellman’s試劑，北京索來寶科技有限公司；2-巰基乙醇(分析純)，北京津同樂泰化工產品有限公司；KBr (光譜純)，天津市金貝爾科技有限公司；甘氨酸、碳酰二胺，國藥集團化學試劑有限公司；5-5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB]、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

便攜式數顯pH計(Testo205)，德圖儀表(深圳)有限公司；電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-6)，北京市永光明醫療儀器有限公司；低速離心機(TDL-5-A)，上海安亭科學儀器廠；紫外-可見分光光度計(TU-1810PC)，北京普析通用儀器有限責任公司；真空冷凍干燥機(ALPHA 1-2)，德國Marin Christ公司；定時恒溫磁力攪拌器(MHY-16310)，北京美華儀科技有限公司；掃描電子顯微鏡(S-5500)，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 改性蛋白的制備

工藝流程：WG→制備溶液→攪拌→調pH→加糖(葡萄糖、乳糖和葡聚糖)→攪拌→調pH→恒溫反應→糖-蛋白復合物→真空冷凍干燥→糖基化蛋白

稱取2.00 g WG分散于去離子水中(蛋白質質量濃度為60～80 g/L)，室溫下攪拌1 h，用1 mol/L NaOH調不同pH，分批加入單糖、雙糖和多糖，不斷攪拌，調溶液pH 7.0終止反應。之后真空冷凍干燥處理，得到糖-蛋白接枝產物。葡萄糖改性蛋白(glucose modified protein，GMP)、乳糖改性蛋白(lactose modified protein，LMP)、葡聚糖改性蛋白(dextran modified protein，DMP)，對照樣品不添加糖類[1]。

1.3.2 溶解度的測定

根據HORAX等[8]方法稍作改動。配制10 g/L的WG、GMP、LMP和DMP各10 mL，攪拌20～30 min，置于離心管中，離心(4 500 r/min，15 min)，取上清液。取空試管，加入考馬斯G-250、去離子水和上清液，振蕩1 min左右，靜置10 min后，波長595 nm處測定。對照組不加上清液。按公式(1)計算：

(1)

式中：m0，樣品蛋白含量；m1，上清液蛋白質含量。

1.3.3 接枝度測定(鄰苯二甲醛)比色法

稱取50 mg OPA，分散在甲醛溶液中，加入SDS、2-巰基乙醇和硼砂溶液，充分混勻后定容，制得OPA溶液[9]。

測定時，準確稱取4.00 mL OPA溶液，加入200 μL樣品，35 ℃水浴2 min后測定吸光值A340；同理，做空白對照組。接枝度按公式(2)計算：

(2)

式中：A0,接枝反應前溶液吸光度；A1,接枝反應后溶液吸光度。

1.3.4 褐變程度的測定

1.3.5 持水性的測定

(3)

式中：m0，蛋白樣品質量；m1，離心管與樣品總質量；m2，離心管與沉淀物質量。

1.3.6 持油性的測定

依照PEDROCHE等[12]的方法，準確稱取0.10 g的WG、GMP、LMP和DMP記為m0，置于離心管中稱量，記為m1，加入5 mL大豆油，振蕩1 min，3 300 r/min離心15 min，吸去殘留油脂，稱量離心管與樣品質量記為m2。按公式(4)計算：

(4)

式中：m0，蛋白樣品質量；m1，樣品與離心管總質量；m2，吸油后樣品與離心管總質量。

1.3.7 起泡及起泡穩定性的測定

起泡性與泡沫穩定性[13]：準確稱取1.00 g的WG、GMP、LMP和DMP溶解于pH 7.0的磷酸緩沖溶液中，取10.0 mL置于25 mL離心管中測定其體積值記為V0，以10 000 r/min的速度均質2 min；記錄均質數據。分別按公式(5)、(6)計算起泡性和泡沫穩定性：

(5)

(6)

式中：V0，初始樣液體積；V1，均質放置0 min后樣液總體積；V2，均質放置30 min后樣液總體積。

1.3.8 熒光分光光度分析

將蛋白置于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)中，使蛋白質量濃度為0.3 mg/mL。在狹縫5 nm，激發波長310 nm條件下進行掃描測定[14]。

1.3.9 紫外分光光度分析

使用pH 7.0的PBS蛋白質量濃度調節為0.1 mg/mL，在200～400 nm波長下掃描測定[15]。

1.3.10 巰基與二硫鍵測定

游離巰基含量的測定：將30 mg樣品分散于Ellman’s試劑中，經均質和4 800 r/min離心15 min，在412 nm波長處使用分光光度計測定[15]。

總巰基含量的測定：將30 mg樣品分散于10.0 mL混合試劑中(精確稱取20.84 g Tris、13.51 g甘氨酸、2.98 g EDTA和960.96 g碳酰二胺，加水定容至1 000 mL)中，在412 nm波長處測量。巰基含量按公式(7)計算：

(7)

式中：A412，吸光度；n，稀釋倍數；m，上清液中蛋白質含量。

NTSB 合成根據PETRUCCELLI等[16]的方法：稱取 1.0 g DTNB 溶解在 100 mL 1 mol/L 的 Na2SO3溶液中，調節 pH 值到7.5。加入 0.5 mL 0.1 mol/L 的 CuSO4氨溶液，38 ℃下保溫。渦旋振蕩至溶液從亮紅色變為淡黃色，-20 ℃冰箱中保存備用。

NTSB 測試液：用 0.2 mol/L 的 Tris-base 緩沖液(10 mmol/L EDTA，0.1 mol/L Na2SO3和 3 mol/L異硫酸胍)將 NTSB 儲液稀釋 100 倍，調節 pH 值到 9.5。

二硫鍵含量的測定：取50 mg蛋白樣品，置于Tris-base緩沖液，加入NTSB溶液，靜置1 h，離心(10 000 r/min 10 min)，在412 nm波長處測量，對照樣品加入NTSB溶液。二硫鍵含量按公式(8)計算：

(8)

式中：SHT，總巰基含量；SHF，自由巰基含量。

1.3.11 圓二色光譜(circulat dichroism,CD)分析

將蛋白用pH 7.0的PBS稀釋為0.3 mg/mL，放置3 h。掃描波長190～250 nm，掃描速率100 nm/min，測試溫度25 ℃[14]。重復8次掃描，取平均值。

1.3.12 掃描電子顯微鏡觀察

將WG和改性蛋白樣品固定于雙面導電膠上，樣品表面噴涂電鍍層，噴金厚度約10 nm，在20 kV電壓下進行掃描，拍樣品圖[17]。

1.4 數據處理

每組試驗做3次重復實驗。運用Excel 2003繪制圖表進行數據分析，光譜圖用儀器自帶系統軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 接枝度與褐變度的測定

衡量糖基化反應的指標一般為接枝度與褐變度。接枝度與褐變度往往反映較為直觀地說明糖基化反應發生的進程，接枝度反映美拉德反應的初級程度,褐變度反映美拉德反應的高級程度。糖基化實質是游離氨基與羰基相互作用形成的共價化合物，新化合物的形成、接枝度的升高是游離氨基減少的主要原因[18]。TURAN等[19]在闡述這種反應的高級階段時，也說明了游離氨基與羰基之間的反應會生成含氮類的棕色、褐色聚合物或共聚物。

由圖1可知，GMP的接枝度最大，其次是DMP，可能是由于分子質量相對較小的糖具有更多的還原性羰基，數量相對較多的羰基更容易與蛋白分子發生反應，處于蛋白分子外部的游離氨基可以更快地與糖分子相互接觸并產生作用，處于蛋白分子內部的氨基會因外部氨基產生反應后也隨之發生相應變化，從而表明接枝度與糖類分子質量有一定相關性。TER等[20]在研究中稱，蛋白分子中氨基所觸發的與糖的反應性可以判定糖基化的反應進程。Maillard反應會有終產物產生，褐變程度的高低順序依次為：LMP>GMP>DMP，說明糖的構型能影響糖基化反應。乳糖和谷蛋白反應體系產生了更多的糖基化產物，從而可以反映出LMP向著高級階段進行，可能是由于反應過程中發生了焦糖化反應和產生了生色團[19]。

圖1 糖基化改性的接枝度與褐變度Fig.1 Grafting degree and browning degree of glycosylation modification

2.2 理化指標的測定

通過表1中改性前后的數據對比，WG的溶解度為17.43%，而GMP、LMP與DMP的溶解度分別為：94.84%、59.62%和98.42%；WG的持水性和持油性分別為：4.27%和4.81%；GMP、LMP與DMP的溶解度與持水性明顯高于WG，而GMP、LMP與DMP的持油性比WG低，分別是WG的78.17%、80.87%和61.54%。這是因為蛋白與糖產生反應，隨著接枝程度的逐漸增大，糖鏈不斷介入到蛋白分子中，為蛋白分子提供了充足的親水性羥基基團，這種親水性基團會在蛋白質的表面形成水化膜，使得核桃谷蛋白的親水性有較為顯著的增加[21-22]。改性后蛋白的起泡性與起泡穩定性平均提高了27.50%與5.39%。

表1 改性前后理化特性的比較Table 1 Comparison of physical and chemical properties before and after modification

2.3 熒光光譜分析

蛋白質是由氨基酸通過肽鍵連接組合成的大分子類物質，具有較大空間和結構。因此這種組合方式使得蛋白質分子內的大量基團，如氨基、羧基和羥基等，在受到外界影響時會發生某些變化，進而影響其功能特性[23]。蛋白的熒光光學性質與發色團結構及其微環境具有緊密聯系，熒光光譜圖顯示接枝反應會使谷蛋白中存在一定量的色氨酸由于光激發產生的電子躍遷，造成微環境改變[24-25]。由圖2可知，在310 nm的激發波長下，WG的熒光峰在428 nm波長處，蛋白質-糖接枝物的熒光峰在431 nm波長處，比較發現，改性蛋白的吸收峰發生紅移，熒光強度都顯著降低，可能是改性使得發色團暴露而發生熒光猝滅。

圖2 核桃谷蛋白與改性蛋白的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of WG and modified protein

此外，接枝物的熒光強度顯著低于WG對照組。GMP、LMP與DMP的糖基化改性，一是由于反應所處的較高溫度，在較高溫度下，蛋白質的構象不穩定，會引起蛋白中的色氨酸大量減少，導致熒光強度降低[26]；二是由于外界環境的改變，使蛋白質由原本的折疊狀態逐漸展開呈伸展狀態，蛋白質此時去折疊化，由順序結構向無序結構化轉變。

2.4 紫外光譜分析

蛋白的表面疏水性對蛋白質三、四級結構有重要作用，蛋白的紫外吸收特性主要基于蛋白質側鏈上的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基的變化[27]。

由圖3所示，WG在284 nm波長處出現最高紫外吸收峰，吸光度為0.47。而改性蛋白的紫外吸收高低順序依次為：GMP>DMP>LMP，接枝產物的吸收峰均出現在276～278 nm波長處，吸收峰藍移，生色基團外在微環境發生了改變[28]，使得肽鏈上具有紫外吸收的色氨酸、酪氨酸殘基表露出來，其所帶的雜環π→π*電子躍遷也是引發吸收峰向短波長方向移動的關鍵因素之一[29]，300～400 nm波長附近的紫外吸光度的波峰消失，變得平滑，可能是改性使核桃谷蛋白中結構得到伸展，電子躍遷能量逐漸減小，導致紫外吸收減弱[30]。

圖3 核桃谷蛋白與改性蛋白的紫外光譜Fig.3 UV-visible spectroscopy of WG and modified protein

2.5 巰基與二硫鍵的測定

巰基與二硫鍵含量對于蛋白質空間構象的穩定起著關鍵作用，二者之間的交換作用可使得蛋白分子間發生凝聚[28]。圖4對比發現，3種改性蛋白的總巰基含量呈下降趨勢，可知糖基化處理使得蛋白質結構改變，WG的巰基大部分游離在蛋白表面，而改性蛋白的巰基相對來說，是包埋或嵌在分子內部。與WG相比，二硫鍵含量高低順序依次為：LMP>DMP>GMP，說明隨著糖基化反應的進行，接枝度高的DMP和GMP所含的二硫鍵是減少的。巰基和二硫鍵不僅可以維持蛋白質分子的結構穩定，還能改變某些功能特性[31]，這些化學鍵的斷裂、結合和重組，都可以使得蛋白質的更高級結構產生一定變化，同時，結構的改變又會作用于蛋白質的功能特性。

圖4 核桃谷蛋白與改性蛋白的巰基與二硫鍵含量Fig.4 —SH and disulfide bond of WG and modified protein注：組間不同小寫字母表示差異顯著

2.6 圓二色光譜分析

WG、GMP、LMP和DMP四種蛋白的主要構成為β-折疊與無規則卷曲，僅存在少量的α-螺旋結構。α-螺旋結構通常存在于蛋白質分子內部，高度有序穩定，不易改變蛋白功能特性[32]。與α-螺旋相比，β-折疊與無規則卷曲結構會使得蛋白質穩定性降低，蛋白的功能特性易被改變。KATO等[33]發現，蛋白分子的柔性越好，其乳化性能越好。

如表2所示，WG以β-折疊結構為主，α-螺旋結構占17.62%，是改性蛋白的1.41倍。經糖基化改性的GMP、LMP和DMP，其α-螺旋結構均呈下降趨勢(P<0.05)，可能是蛋白質和糖共價結合后，α-螺旋結構遭到破壞，蛋白結構分子發生伸展。與對照組相比，改性處理使蛋白的β-折疊、β-轉角和無規則卷曲結構在整體上變化不明顯，但含量均增加了約1.06倍。說明接枝反應后的GMP、LMP和DMP在溶液中結構向無序轉變，增加了蛋白的不規則性。

表2 核桃谷蛋白與改性蛋白二級結構變化的對比分析 單位：%Table 2 Comparative analysis of secondary structure changes between WG and modified proteins

2.7 掃描電鏡對WG與改性蛋白的觀察

如圖5所示，未改性的WG顆粒大小不一，大多呈散落小顆粒圓球狀堆積結構。經糖基接枝反應后的GMP、LMP與DMP所形成的是質地十分緊密的較大塊狀結構，且這種結構的表面均表現出一定的光滑性，有較為明顯的棱角質地感，且所形成的塊狀大小以及規模更加趨近于晶體化。

對比發現，對核桃谷蛋白進行改性處理后，大部分以片層或塊狀結構存在，體積較大。這可能是因為WG與糖基共價結合，分子間的疏水作用減弱，大分子物質分散開來，使得接枝物呈現展開的結構特點，有助于蛋白質溶解性、水合能力的提升[34]。

a-WG(5 000×);b-GMP(5 000×);c-LMP(5 000×);d-DMP(5 000×);e-WG(10 000×);f-GMP(10 000×);g-LMP(10 000×);h-DMP(10 000×)圖5 核桃谷蛋白及其糖基化接枝物的SEM圖Fig.5 The SEM micrographs of WG and its glycosylation grafting

3 結論

經糖基化改性，GMP、LMP與DMP接枝反應較充分，溶解度與持水性均有較大幅度提高，但由于接枝物構象限制，起泡特性變化較小，總體上變化并不明顯。結合熒光光譜圖分析，接枝產物的吸收峰發生變化，可知分子內部的氨基酸基團極性狀態發生了一定改變，使得蛋白質的高級結構發生相應改變，且熒光強度及吸收強度也被影響，蛋白的親水性以及疏水性發生了變化。蛋白的游離巰基是決定親水性的主要原因，蛋白分子內部以及分子間化學鍵變化，都可以引發蛋白相對高級結構變化，而結構表征性變化又會影響到蛋白外在功能特性。掃描電子顯微鏡顯示，糖基化修飾會影響蛋白分子的微觀結構，對蛋白質理化性質也有影響。圓二色光譜分析得出，接枝物的α-螺旋結構有較為明顯的下降，β-折疊、β-轉角和無規則卷曲結構在整體上未發生顯著性變化，說明糖基化修飾使得谷蛋白二級結構遭到破壞。

在相關科學研究中，毛曉英課題組[35-37]在蛋白質結構氧化性修飾對核桃蛋白結構和乳化特性影響的研究中發現，適當的氧化濃度有利于提高核桃蛋白的乳化活性和乳化穩定性。孫乾等[25]采用?；c磷酸化對核桃谷蛋白進行改性處理，發現蛋白的溶解度、持水性均得到提升，與本研究結果相似。化學法對谷蛋白的改性效果極為明顯，但可能會帶來蛋白的不可逆變性或有與蛋白結合緊密的殘存物質。薛雨菲等[38]和張愛琴等[39]運用復合蛋白酶和谷氨酰胺轉氨酶改性核桃谷蛋白，發現酶解可使深藏于蛋白質內部的親水性基團逐漸暴露而改善蛋白質的功能特性。酶法反應溫和，但在功能特性的改變上并非有較大差異性，且會在蛋白質酶解時產生苦味。糖基化修飾對蛋白的功能特性有較為顯著的改變，但研究發現反應易受溫度、pH以及時間等因素影響，從而使改性后的蛋白有較濃重的色澤干擾，這直接影響了產品的感官特性[7]。在改性技術上，應更可能地選擇物理、化學、酶法以及糖基化法等多技術方法聯用，規模化生產具有安全性、穩定性、高附加值的核桃蛋白。