牡蠣殼超細球霰石碳酸鈣的制備與表征

高平章，艾楊城，鐘榕榕，翁文婷，孫麗丹，呂鳳嬌，謝曉蘭

(泉州師范學院 化工與材料學院，福建 泉州, 362000)

牡蠣是我國沿海地區的四大養殖貝類之一，也是我國衛生部門批準的第一批藥食同源的海產品之一[1]。福建地處沿海，近年來牡蠣養殖量逐年增加，產量約占全國的40%，是國內最大的養殖省份[2]。開發利用牡蠣殼日益受到關注。

牡蠣殼中，碳酸鈣占總質量的90%～95%，鈣元素含量達40%左右[3-5]，是一種良好的自然生物鈣源。以牡蠣殼為原料制備成各種食藥級鈣劑的研究受到廣泛關注，已有以牡蠣殼為原料制備的各種鈣制劑[1,6-12]。不同鈣制劑不僅含鈣量不同，鈣的吸收率也不同，常用的葡萄酸鈣、乳酸鈣、碳酸鈣等補鈣劑的吸收率分別為27%、32%、39%[13]，高的含鈣量和吸收率使碳酸鈣補鈣劑具有更好的市場前景。

但碳酸鈣補鈣劑需通過胃酸分解解離出Ca2+，才可被消化吸收，過程中產生的CO2會引發噯氣，不適用于胃潰瘍等消化道疾病患者，故改進天然碳酸鈣晶體結構和組成，對擴大碳酸鈣補鈣劑的可適用人群具有良好的研究價值。

碳酸鈣主要有方解石、文石、球霰石等3種熱力學穩定性依次下降的晶體結構，天然形成的牡蠣殼碳酸鈣是多糖、蛋白質等有機基質含量較少的熱穩定的方解石和文石，熱力學不穩定的球霰石碳酸鈣一般只有在實驗室中添加適當的晶型控制劑調控才能形成[14-15]。球霰石具有高比表面積、低密度、易溶性、易分散性、良好的生物安全性等特點，作為食藥級鈣劑具有更好的吸收性和可利用性[16]。近年來，國內外相繼有蔗糖、淀粉等糖類和牛血清白蛋白、胃蛋白酶等蛋白質類作為晶型控制劑調控仿生礦化形成球霰石型碳酸鈣的研究報道[17-21]。

胰蛋白酶是一種水溶性的蛋白水解酶，能特異性水解堿性氨基酸羧基形成的肽鍵，Ca2+對其具有保護和激活作用，臨床上主要應用于消化道潰瘍、炎癥、創傷性損傷等[22-26]。以牡蠣殼為原料，胰蛋白酶為調控劑制備鍵合胰蛋白酶的球霰石超微細碳酸鈣的研究至今未見報道。

論文探索了牡蠣殼經粉碎、乳酸溶提活性鈣后，在胰蛋白酶調控下采用碳化法制備球霰石型的超細碳酸鈣工藝，并通過掃描電鏡、紅外光譜等手段表征分析了產品組成與形貌特征，以期為牡蠣殼的開發利用，制備適用于消化道潰瘍人群的新型食藥級補鈣制劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣殼，福建泉州恒達制藥有限公司；99.9% CO2氣體，泉州市豐澤區東流焊接材料經營部。

乙二胺四乙酸二鈉(分析純)，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；氯化鈉(分析純)、氨水(分析純)，西隴科學股份有限公司；乳酸(藥典級)、胰蛋白酶(生物試劑)，羅恩試劑；鈣羧酸指示劑(分析純)，阿拉丁試劑；其他試劑均為分析純，國藥集團；實驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

DGG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；JY3002電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；AR124CN分析天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；DFY-200搖擺式高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；FE28 pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；YP-2壓片機，上海山岳科學儀器有限公司；NICOLET iS 10紅外光譜儀，Thermo Fisher SCIENTIFIC；ZEISS MERLIN Compact掃描電鏡，德國Zeiss公司；STA 409 PC熱重分析儀，NETZSCH。

1.3 實驗方法

1.3.1 牡蠣殼的預處理

近江牡蠣殼用自來水沖洗，并用刷子刷去附著的泥沙及其他雜質，反復沖洗干凈后用蒸餾水浸泡1 h，濾干后在電熱恒溫鼓風干燥箱中80 ℃烘干6 h，再用萬能粉碎機粉碎至粉末狀，過100 目篩，裝瓶備用。

1.3.2 牡蠣殼乳酸溶提液的鈣含量測定

采用EDTA滴定法[12]：取25 mL牡蠣殼乳酸溶提稀釋液于錐形瓶并用氨水調至pH 12～13，再加入適量鈣羧酸指示劑，充分搖勻后用EDTA標準溶液滴定，當溶液由玫瑰紅色變為亮藍色，終止滴定并記錄消耗的EDTA標準液體積，每個樣品平行滴定2次，取平均值計算牡蠣殼活性鈣的溶提率如公式(1)所示：

(1)

式中：c，EDTA標準溶液濃度，mol/L；V，滴定消耗的EDTA標準溶液體積，mL；n，乳酸溶提液稀釋倍數；V總，乳酸溶提液總體積，mL；M，鈣摩爾質量，g/mol；m，牡蠣殼粉質量，g。

1.3.3 乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的工藝條件優化

先用單因素實驗考察乳酸濃度、反應溫度、反應時間、攪拌速度等因素對牡蠣殼活性鈣溶提率的影響，確定各因素的較佳取值。在此基礎上，再用正交實驗對工藝條件進一步優化。所有實驗均做3個平行組。

1.3.4 胰蛋白酶調控的牡蠣殼納米碳酸鈣制備

在優化工藝條件下，用乳酸溶提牡蠣殼活性鈣，溶提液過濾后，根據碳酸二級解離常數(pKa2=10.2)和胰蛋白酶等電點(pI=10.1～10.8)，為了保證反應體系中的胰蛋白酶帶負電，能與Ca2+鍵合反應并碳化成碳酸鈣，溶提液先用氨水調節溶液至pH 11～12，再按不同比例的酶鈣質量比分別加入適量胰蛋白酶，攪拌溶解完全后，在25 ℃下，以1 L/min的流速持續通入CO2氣體5 min，碳化制備碳酸鈣，所得產品用去離子水充分洗滌后用恒溫鼓風干燥箱在105 ℃下干燥至恒重。同時為了節約成本，碳化后母液中的胰蛋白酶可以回收循環利用。

1.3.5 碳酸鈣產品表征

1.3.5.1 掃描電鏡形貌分析

掃描電鏡分析和測定碳酸鈣產品形貌即粒徑。樣品采用直接分散法：將導電膠剪成合適大小，直接粘在銅片上，待測樣品借助外物直接散落在導電膠上，用吸耳球輕輕吹試樣，除去未附著在導電膠上的樣品。接著進樣，選擇合適的放大倍數觀察樣品的外觀形貌及粒徑大小。

1.3.5.2 紅外光譜定性分析

取100～200 mg KBr粉末于瑪瑙研缽中，再加入約2 mg的碳酸鈣樣品，充分研磨后，取樣壓片，以KBr空白片劑作參照，在波長4 000～400 cm-1內掃描紅外光譜，分析鑒定產物特征官能團。

區內巖漿活動頻繁，巖漿巖種類繁多，具多期多次活動的特點，既有噴出巖，又有侵入巖，中元古代以火山噴發為主，印支期、燕山期巖漿侵入形成各種巖脈和巖體。

1.3.6 數據統計分析

用Excel 2007軟件對單因素實驗數據進行顯著性分析，實驗結果以平均值±標準差表示；正交實驗結果用SPSS 18.0軟件進行顯著性差異分析，以P<0.05 表示差異顯著；用Grapher 8.0 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素法考察乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的工藝條件

2.1.1 溫度對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響

分別取牡蠣殼粉10.00 g，按m(牡蠣殼)∶V(乳酸溶液)=1∶20 的固液比加入1.0 moL/L的乳酸溶液后，在不同反應溫度下，300 r/min攪拌反應30 min，測定分析牡蠣殼活性鈣的溶提率，考察溫度對牡蠣殼活性鈣溶提率的影響。結果如圖1所示，溫度對活性鈣溶提率的影響呈鐘罩型趨勢，溫度低于55 ℃時，鈣溶提率隨著溫度升高而升高；溫度高于65 ℃時，鈣溶提率隨溫度升高而下降；在55 ℃與65 ℃下，鈣溶提率分別為39.22%、39.28%，溶提效果相當并取得良好效果。對實驗數據進行單因素方差分析，顯示溫度對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響具有顯著性。

圖1 溫度對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響Fig.1 Effect of temperature on calcium extraction rate of oyster shell by lactic acid

溫度升高加快體系溶質分子的運動速度，有助于牡蠣殼碳酸鈣的溶解，提高其與乳酸的化學反應速度；但溫度升高到一定程度，對放熱反應產生抑制，不利于活性鈣的溶提。根據實驗結果，結合節能減排，確定55 ℃為較佳牡蠣殼活性鈣的溶提溫度。

2.1.2 反應時間對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響

圖2 反應時間對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響Fig.2 Effect of reaction time on calcium extraction rate of oyster shell by lactic acid

2.1.3 乳酸濃度對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響

分別取牡蠣殼粉10.00 g，按1∶20固液比分別加入不同濃度的乳酸溶液，在55 ℃、300 r/min下分別攪拌反應30 min后，測定分析牡蠣殼活性鈣的溶提率，考察乳酸濃度對牡蠣殼活性鈣溶提率的影響。圖3表明，當乳酸濃度低于1.5 moL/L時，牡蠣殼活性鈣的溶提率隨著乳酸濃度升高快速提升；乳酸濃度在1.5～2.5 moL/L范圍內，隨著乳酸濃度升高鈣溶提率上升緩慢并趨于平穩，乳酸濃度為2 moL/L時，溶提率最大，為39.28%；乳酸濃度大于2.5 moL/L時，牡蠣殼活性鈣的溶提率隨著乳酸濃度升高呈輕微下降趨勢。單因素方差分析顯示乳酸濃度對牡蠣殼鈣溶提率的影響具有顯著性。

圖3 乳酸濃度對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響Fig.3 Effect of lactic acid concentrations on calcium extraction rate of oyster shell by lactic acid

乳酸濃度對牡蠣殼鈣溶提率影響遵循反應物濃度對反應效率的影響。當加入低于1 moL/L的乳酸溶液時，反應體系的乳酸量不足，導致牡蠣殼活性鈣不能完全溶提出來；加入1 moL/L的乳酸溶液，乳酸與牡蠣殼碳酸鈣剛好能達到理論完全反應比例，但由于反應的可逆性及牡蠣殼中少量雜質影響，該乳酸濃度仍不能把牡蠣殼活性鈣完全溶提；加入1 moL/L<濃度<2 moL/L的乳酸溶液，體系中的乳酸適當過量，可保證牡蠣殼活性鈣被完全溶提出；當乳酸濃度為2 moL/L時，牡蠣殼活性鈣溶提效果最好，溶提率達39.28%；但隨著加入乳酸濃度進一步升高，乳酸過量時，乳酸之間容易發生聚合反應，反而影響牡蠣殼活性鈣的溶提效果。故確定2 moL/L的乳酸濃度為較佳提取濃度。

2.1.4 攪拌速度對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響

分別取牡蠣殼粉10.00 g，按1∶20固液比加入2.0 moL/L的乳酸溶液，55 ℃下，在不同攪拌速度下反應30 min后，測定分析牡蠣殼活性鈣的溶提率，考察攪拌速度對牡蠣殼活性鈣溶提率的影響。圖4顯示，攪拌速度低于300 r/min時，牡蠣殼活性鈣的溶提率隨著攪拌轉速逐漸增加而升高，當攪拌轉速為300 r/min時，鈣的溶提率最大，達39.28%；而攪拌速度高于300 r/min時，牡蠣殼活性鈣的溶提率表現出快速下降趨勢。單因素方差分析顯示攪拌速度對牡蠣殼鈣溶提率的影響具有顯著性。

圖4 攪拌速度對乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的影響Fig.4 Effect of stirring speed on calcium extraction rate of oyster shell by lactic acid

攪拌有助于乳酸和牡蠣殼粉在反應體系中的分散，適當攪拌有助于兩者之間的充分接觸，提高反應；但隨著攪拌速度提高，一方面會導致兩者接觸時間縮短，不利于反應，另一方面也會加速乳酸自身的聚合反應，不利于牡蠣殼碳酸鈣的溶提。故確定較佳攪拌速度為300 r/min。

2.2 正交試驗優化乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的工藝條件

根據單因素實驗結果，固定反應時間30 min，以對鈣溶提率有顯著性影響的乳酸濃度、反應溫度、攪拌速度等為考察因素，每個因素在單因素實驗確定的較佳值周邊選擇3個水平，按L9(34)正交表進行試驗設計組合出9個實驗方案，以牡蠣殼活性鈣的溶提率為考察指標，確定出不同濃度乳酸溶液提牡蠣殼活性鈣的最佳工藝條件。具體的實驗方案及實驗結果極差分析見表1，實驗結果的SPSS方差顯著性分析見表2。

由表1可知，乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的最佳工藝條件是乳酸濃度為2 moL/L，溫度為50 ℃，攪拌速度為350 r/min，乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的溶提率可達39.46%。通過R值可知，3個因素對鈣溶提率的影響主次順序為：攪拌速度>乳酸濃度>溫度。表2分析結果顯示，3個因素對鈣溶提率均有顯著性影響。

表1 乳酸提取牡蠣殼活性鈣的正交實驗方案及實驗結果Table 1 The schemes and results of orthogonal experiments about calcium of oyster shell extracted by lactic acid

表2 正交試驗結果方差統計分析Table 2 Statistical analysis of variance of orthogonal test results

圖5中的a、b、c、d、e、f分別是未加胰蛋白酶、按0.1∶1、0.15∶1、1∶1、2∶1、3∶1的酶鈣質量比添加胰蛋白酶調控制備的牡蠣殼碳酸鈣的SEM圖像。

2.3 胰蛋白酶調控對牡蠣殼納米碳酸鈣的形貌影響

根據1.3.4的牡蠣殼納米碳酸鈣制備方法，分別按0∶1、0.1∶1、0.15∶1、1∶1、2∶1、3∶1的酶鈣質量比，往牡蠣殼活性鈣乳酸溶提液中加入胰蛋白酶，攪拌溶解完全后，碳化法制備碳酸鈣，制備產品充分洗滌后置于105 ℃的恒溫鼓風干燥箱中干燥至恒重。對樣品進行掃描電鏡、外紅光譜測試分析，研究胰蛋白酶調控對牡蠣殼納米碳酸鈣的形貌和結構的影響。

2.3.1 掃描電鏡形貌分析

采用掃描電鏡(SEM)測定分析不同量胰蛋白酶調控下制備的牡蠣殼碳酸鈣產品的形貌和粒徑差別。

從圖5-a中可見，牡蠣殼乳酸溶提鈣液在未添加胰蛋白酶的情況下，碳化形成的碳酸鈣是由許多納米級的球狀顆粒緊密團聚而成的直徑為5 ～ 10 μm的微球，外觀形貌與王芬等用CaCl2溶液碳化法制備的碳酸鈣相似[16]；圖5-b、5-c顯示，按0.1∶1和0.15∶1的酶鈣質量比加入不同量的胰蛋白酶調控，碳化制備的碳酸鈣微球粒徑雖有所下降，但尺度仍在1 μm以上。物質之間一般按摩爾比例相互作用，考慮胰蛋白酶分子量為24 000 Da，跟Ca2+相比，比較大，故提高了酶鈣質量比至1∶1、2∶1、3∶1，由圖5-d、5-e、5-f可見，碳酸鈣微球粒徑隨著胰蛋白酶添加量增大明顯減小，納米顆粒的團聚由緊密趨向蓬松，微球大小均一性也越來越好。由圖5-f可知，按3∶1酶鈣質量比添加了胰蛋白酶調控碳化制備碳酸鈣，可制備得到大小均一、粒徑300～400 nm的蓬松微球。SEM表征結果說明胰蛋白酶的添加能有效分散納米碳酸鈣，防止納米碳酸鈣的團聚，這對補鈣制劑或食品鈣強化劑的開發具有重大的意義，將有助于提高鈣的吸收利用。

a→f-酶鈣質量比:0∶1、0.1∶1、0.15∶1、1∶1、2∶1、3∶1圖5 不同量胰蛋白酶調控下制備的碳酸鈣的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope of calcium carbonate prepared under the control of different amounts of trypsin

2.3.2 紅外光譜分析

不同晶型的碳酸鈣具有不同的紅外光譜特征峰，方解石碳酸鈣的紅外特征吸收峰主要在1 462、876和712 cm-1；文石碳酸鈣特征吸收峰在1 485、1 082、875、712和700 cm-1；球霰石的特征吸收峰為1 490～1 420、1 085 cm-1、1 070、870～830和743 cm-1。方解石、文石和球霰石的主要鑒別位點分別在712、700和743 cm-1[16-17]。

圖6 未加胰蛋白酶的碳酸鈣紅外譜圖Fig.6 Infrared spectrum of calcium carbonate without trypsin

圖7 加胰蛋白酶的碳酸鈣紅外譜圖Fig.7 Infrared spectrum of calcium carbonate with trypsin

蔗糖、牛血清白蛋白等糖類和蛋白質類物質作為晶型控制劑調控球霰石型碳酸鈣的形成，主要是因為添加劑中的—OH、—COOH等極性官能團和C—O等極性鍵會與碳酸鈣發生作用，誘導球霰石型的生成[17,20]。研究顯示胰蛋白酶調控下對牡蠣殼活性鈣乳酸溶提液碳化制備的碳酸鈣晶型沒有影響，可能是因為體系介質中本來就含帶—OH、—COOH等極性官能團和C—O極性鍵的乳酸，可誘導球霰石型碳酸鈣的生成，故添加胰蛋白酶調控只影響碳酸鈣微團的致密性和粒徑，不影響晶型。

3 結論

牡蠣殼洗凈粉碎成100目粉末，乳酸溶提活性鈣液后通入CO2，可碳化制備球霰石型納米顆粒團聚而成的微球。單因素結合正交試驗確定了乳酸溶提牡蠣殼活性鈣的最佳工藝條件：反應時長為30 min，乳酸濃度為2 moL/L，溫度為50 ℃，攪拌速度為350 r/min，在此最佳條件下，牡蠣殼活性鈣的溶提率可達39.46%，乳酸基本能將牡蠣殼中的鈣溶解出來。單因素實驗數據方差分析顯示乳酸濃度、溫度、攪拌速度均對鈣溶提率有顯著性影響，但反應時間對鈣溶提率沒有顯著性影響；正交試驗結果表明乳酸濃度、溫度、攪拌速度等3個因素對鈣提取率的影響主次順序為：攪拌速度>乳酸濃度>溫度。

考察牡蠣殼活性鈣乳酸溶提液在胰蛋白酶調控下，碳化結晶生成的碳酸鈣的形貌及粒徑等的變化。掃描電鏡和紅外光譜的結果表明，與沒有胰蛋白酶調控下制備的碳酸鈣晶體比較，胰蛋白酶調控下制備的碳酸鈣晶型沒有改變，均為球霰石型；但在胰蛋白酶存在下，碳酸鈣納米顆粒在團聚成微球時會夾雜鍵合部分有機質胰蛋白酶，使納米顆粒團聚蓬松，團聚而成的微球粒徑由5～10 μm下降至300～400 nm，且大小較均一。得到的產品如果開發為補鈣制劑或食品鈣強化劑時，將更容易被溶解、吸收。