脫酰胺對玉米醇溶蛋白乳化特性和結構的影響

董世榮，王麗，高昂，徐微

1(哈爾濱學院 食品工程學院食品系，黑龍江 哈爾濱，150086)2(濟南市第二藥品不良反應監測中心，山東 濟南，271100)

乳液在食品、化妝品、生物技術和醫藥產品等領域有著廣泛地應用[1]，其是2種互不相容液體(一般為油和水)組成的非均相分散體系，一種液體以細液滴形式均勻地分散在另一種液體中，它們在熱力學上是不穩定的，乳化液很容易發生絮凝、乳脂化、沉降、聚結、相轉化等[2]。通過添加乳化劑，在均質化過程中，乳化劑吸附在液滴表面而降低界面張力，進而改善乳液的穩定性[1]。近年來，天然高分子材料如蛋白質、多糖、磷脂常作為乳化劑應用到食品領域。

玉米醇溶蛋白是一種從玉米粉中分離出的植物蛋白質，因具有良好的生物降解性、環保、無毒、成膜性、可食用性等優點而被作為一種有價值的食品原料[3]。玉米醇溶蛋白具有特殊的氨基酸組成和結構特點，含有超過50%的非極性氨基酸而具有較強的疏水性[4]，因此不易溶于水而易分散在50%～90%的乙醇-水溶液中。MATSUSHIMA等[5]提出玉米醇溶蛋白是1個13 nm×1.2 nm×3 nm的棱鏡模型，該模型中含有9～10個以反平行方式排列的螺旋段，螺旋兩端由富含谷氨酰胺的橋連接。基于此模型，螺旋外表面形成的棱柱體的側面是疏水的，而富含谷氨酰胺的棱柱體的上下表面是親水的，因此玉米醇溶蛋白屬于雙親性蛋白質[6]，但是由于玉米醇溶蛋白的剛性太強，不能作為良好的乳化劑使用。

為了改善玉米醇溶蛋白的剛性結構，很多研究人員采用了堿、酶、熱處理、復合等方式修飾玉米醇溶蛋白。張京京等[7]利用堿性蛋白酶修飾玉米醇溶蛋白，改善了玉米醇溶蛋白的乳化性。趙城彬等探究了葡聚糖接枝作用對玉米醇溶蛋白乳化性的影響，結果發現接枝反應能夠提高玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩定性[8]。CABRA等利用堿對玉米醇溶蛋白進行脫酰胺修飾，發現玉米醇溶蛋白的乳化穩定性從(18±0.7)%增加至(80±4.7)%[9]。李丹等研究發現脫酰胺的乳清分離蛋白的乳化穩定性比未脫酰胺乳化穩定性高[10]。SELLING等在25～70 ℃條件下熱處理玉米醇溶蛋白，發現70 ℃加熱15 min可以改變玉米醇溶蛋白的初級結構[11]。柔性是決定蛋白質功能性質的重要因素之一，分子柔性實質上反應了蛋白質構象的運動性，而功能性質如乳化性質與蛋白質構象的運動性密切相關[12]。這些研究說明了采用堿、熱等方式可以改變玉米醇溶蛋白的結構和乳化特性，而且堿修飾使得玉米醇溶蛋白發生脫酰胺反應，從而改善玉米醇溶蛋白的乳化性。但是脫酰胺度對乳化性影響規律，以及脫酰胺度對玉米醇溶蛋白構象的影響并沒有系統的研究報道。因此，本研究在堿-水介質環境中利用堿對玉米醇溶蛋白進行脫酰胺，通過控制加熱時間調節脫酰胺度，研究脫酰胺度與玉米醇溶蛋白乳化穩定性和乳化活性的變化規律，同時分析了脫酰胺的玉米醇溶蛋白分子構象、柔性的變化，以期為開發玉米醇溶蛋白天然乳化劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Z3625型玉米醇溶蛋白、胰蛋白酶、十二烷基磺酸鈉，美國Sigma公司；大豆油，九三集團；其他試劑均為國產分析純。

T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；F-4500熒光分光光度計，日本日立公司；UV-2550 紫外可見光分光光度計，日本島津公司；FSH-2A可調高速勻漿機，常州金壇精達儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

將玉米醇溶蛋白分別分散至均含有7.5 mmol/L NaOH的水溶液、50%、60%、70%、80%、90%(體積分數)乙醇-水溶液等6種介質中，在室溫下磁力攪拌1 h，配制成質量濃度為10 mg/mL的6份不同的玉米醇溶蛋白溶液，然后在65 ℃加熱不同時間(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)。將不同處理后的玉米醇溶蛋白溶液進行旋轉蒸發除去乙醇，然后凍干，作為后續試驗樣品。

1.2.2 脫酰胺度的測定

采用苯酚-次氯酸鹽法測定脫酰胺度[13]。

試劑A的配制：分別準確稱取5.0 g苯酚、25 mg亞硝基鐵氰化鈉，加入雙蒸水定容至500 mL，移入棕色試劑瓶中備用。

試劑B的配制：準確稱取2.5 g NaOH并溶于雙蒸水中，移取4.2 mL次氯酸鈉溶液加入到NaOH溶液中，并定容至500 mL，移入棕色試劑瓶中備用。

準確移取5.0 mL試劑A于試管中，加入20 μL不同濃度的(NH4)2SO4標準溶液(質量濃度為0.1、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/L)或者待測樣品，充分振蕩、混勻。然后準確移取5.0 mL試劑B加入到上述混合溶液中，充分振蕩、混勻。迅速轉移至水浴鍋中，在37 ℃下水浴顯色20 min。然后冷卻至室溫，在625 nm處測定溶液吸光值。每個濃度做3個平行。

根據所測定的樣品游離氨含量及總酰胺含量，按公式(1)計算脫酰胺度:

(1)

1.2.3 乳化性的測定

參照PEARCE等的濁度法[14]測定乳化活性和乳化穩定性。分別取3 mL質量濃度均為1 mg/mL的不同脫酰胺度的玉米醇溶蛋白溶液和1 mL一級大豆油混合，12 000 r/min均質1 min，靜置，分別在0 min和10 min從距離容器底部0.5 cm處的相同位置取50 μL乳狀液于裝有5 mL質量濃度為1 mg/mL的SDS溶液中，旋渦振蕩，混合均勻，然后在500 nm波長下測定吸光值，其中以1 mg/mL的SDS溶液進行調零。乳化活性指數和乳化穩定性按照公式(2)和公式(3)進行計算：

(2)

(3)

式中：T=2.303；A0，乳化液靜置0 min時在500 nm下的吸光值；ρ，蛋白質質量濃度，g/mL；φ，油在溶液中的體積分數，%；n,稀釋倍數；A10，乳化液靜置10 min時在500 nm下的吸光值。

1.2.4 內源性熒光光譜的測定

參照DEL等的方法[15]，使用熒光分光光度計對樣品進行熒光掃描。具體參數如下：激發波長280 nm，發射光譜為290～450 nm，掃描速度100 nm/min，激發和發射狹縫寬度均為10 nm，電壓700 mV。每個樣品測定重復3次。所有數據均在室溫下收集。

1.2.5 紫外吸收光譜的測定

紫外吸收光譜的測定參考SUN等的方法[16]，將樣品濃度進行適當稀釋，掃描范圍在200～450 nm，掃描速度200 nm/s。

1.2.6 表面疏水性熒光光譜的測定

以8-苯氨基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)為熒光劑，參照CHAUDHURI等[17]的方法對蛋白樣品進行表面疏水性熒光光譜掃描。將待測樣品用0.01 mol/L的磷酸緩沖液稀釋成質量濃度為0.015 mg/mL，然后加入20 μL的8 mmol/L的ANS溶液，利用旋渦振蕩器混勻，避光室溫下反應15 min，然后在激發波長為390 nm，發射波長為400～600 nm進行掃描，激發和發射波長的狹縫均為5 nm，試驗在室溫下進行，每個樣品掃描3次，獲得表面疏水性熒光光譜。

1.2.7 分子柔性的測定

以蛋白質對胰蛋白酶的敏感度表征分子柔性[18]，利用0.05 mol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制1 mg/mL胰蛋白酶溶液。取250 μL胰蛋白酶液加入到4 mL質量濃度為1 mg/mL脫酰胺修飾后的玉米醇溶蛋白溶液〔m(蛋白)∶m(酶)=16∶1〕中，38 ℃水浴恒溫5 min，反應結束后加4 mL質量濃度為50 g/L三氯乙酸終止反應，離心后取上清液測定其在280 nm下的吸光度，用吸光度A表征量化柔性的大小。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對脫酰胺度的影響

研究發現，玉米醇溶蛋白在不同溶劑(0、50%、60%、70%、80%、90%體積分數的乙醇-水溶液)中脫酰胺度隨著加熱時間延長呈現增長的趨勢(圖1)。

a-0%乙醇; b-50%乙醇; c-60%乙醇; d-70%乙醇; e-80%乙醇; f-90%乙醇圖1 在不同加熱時間條件下乙醇濃度對脫酰胺度的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on deamidation degree of zein at different heating time

由圖1可知，其中在水溶劑中脫酰胺度的變化幅度最大，從加熱0 h的0.89%增加至加熱10 h的34.70%。玉米醇溶蛋白分散至堿-水介質時需要一定時間，在溶解期間也發生了脫酰胺反應。在含有7.5 mmol/L的NaOH的50%、60%、70%、80%、90%體積分數的乙醇-水溶液中，玉米醇溶蛋白在加熱0 h時的脫酰胺度幾乎為0，當加熱10 h時，玉米醇溶蛋白的脫酰胺度分別為3.06%、1.95%、1.89%、1.69%、1.35%，表明脫酰胺度隨著乙醇濃度的增加而呈現變小的趨勢。而且與玉米醇溶蛋白在水溶劑中的脫酰胺度相比，在乙醇-水溶液中玉米醇溶蛋白的脫酰胺度均很小。改變溶劑類型可改變玉米醇溶蛋白的二級或三級結構，從而改變其反應位點的可接近性[11]。為研究脫酰胺度對玉米醇溶蛋白的界面性質的影響，選用堿-水作為溶劑對玉米醇溶蛋白進行脫酰胺作用。

2.2 脫酰胺度對乳化活性和乳化穩定性的影響

乳化活性和乳化穩定性是直接反應乳化特性的重要指標。不同脫酰胺度玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩定性見圖2。

圖2 脫酰胺度對乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.2 The effect of deamidation degree on the emulsion active index and emulsion stability

圖2乳化活性和乳化穩定性隨著脫酰胺度的增加均呈現上升趨勢。玉米醇溶蛋白在脫酰胺度較低(DD=0.89%)時，乳化活性僅為1.07 m2/g，可能是因為此時玉米醇溶蛋白表面活性較低[19]，無法很好地形成良好的乳化液。但是當脫酰胺度增加至34.70%時，玉米醇溶蛋白的乳化活性增加至3.69 m2/g，增加的幅度達244.86%。脫酰胺度的提高也改善了玉米醇溶蛋白乳化液的穩定性，當脫酰胺度從0.89%增加至34.70%時，玉米醇溶蛋白的乳化穩定性從6.32%增加至73.05%，增加的幅度為1 055.85%。脫酰胺度較低的玉米醇溶蛋白黏度較低、表面疏水力較高，促進了乳化液滴的聚集絮凝[20]，從而表現出較差的乳化穩定性。除了黏度和表面疏水性，分子柔性也是影響蛋白質乳化性的重要因素，因為分子柔性可以促進蛋白質分子和油表面的相互作用[9]，脫酰胺度可能會改變玉米醇溶蛋白的分子柔性。

2.3 脫酰胺度對乳化活性和乳化穩定性歸一化結果的影響

為定量反映脫酰胺度對玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩定性的影響規律，本研究采用單指數函數擬合脫酰胺度和歸一化的乳化活性和乳化穩定性的關系〔乳化活性歸一化(EAIg)：不同脫酰胺度時的乳化活性與脫酰胺度為0.89%時平均乳化活性的比值；乳化穩定性歸一化(ESIg)：不同脫酰胺度時的乳化穩定性與脫酰胺度為0.89%時平均乳化穩定性的比值〕。如圖3所示。

a-乳化活性歸一化-脫酰胺度; b-乳化穩定性歸一化-脫酰胺度圖3 脫酰胺度對乳化活性和乳化穩定性歸一化結果的影響Fig.3 The regressed result of generalized emulsion active index and emulsion stability as a function of deamidation degree

EAIg和ESIg最小二乘法回歸分析可表示為:

EAIg=0.063 84x+1.322 5

(4)

ESIg=0.316 75x+0.288 64

(5)

2.4 脫酰胺后表面疏水性的變化

表面疏水性反映了蛋白質表面的疏水基團含量，與蛋白質的性質息息相關。本試驗采用ANS熒光探針的方法對玉米醇溶蛋白的表面疏水性進行測定。從圖4可以看出，脫酰胺度在0.89%時，玉米醇溶蛋白表現出較高的表面疏水性；當脫酰胺度增加至34.70%時，玉米醇溶蛋白的表面疏水性降低。脫酰胺反應使得疏水酰胺基團形成親水性的羧基，從而降低了蛋白質的表面疏水性[21]。

圖4 不同脫酰胺度的玉米醇溶蛋白的表面疏水性的變化Fig.4 Surface hydrophobicity change of zein at various deamidation degree

2.5 內源性熒光光譜分析

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸是蛋白質中發射內源性熒光的氨基酸，在激發波長為280 nm時，內源性熒光通常取決于色氨酸和酪氨酸殘基，與酪氨酸相比，色氨酸對環境變化更敏感，因此內源性熒光的強度主要來源于色氨酸[22]。通過測定蛋白質中色氨酸的熒光強度變化可以反映蛋白質的結構、穩定性、折疊和展開參數以及動態變化[23]。當蛋白質結構展開，發色團暴露于溶劑中會降低熒光強度[24-25]。從圖5看出，在玉米醇溶蛋白脫酰胺度(DD=0.89%)很低時，色氨酸發色團的峰值約330 nm，這是色氨酸在一個相對疏水環境中的一個特定峰值[24]。但是當玉米醇溶蛋白的脫酰胺度達到34.70%時，內源性熒光強度的峰值消失，沒有出現明顯的峰值，可能由于脫酰胺破壞了玉米醇溶蛋白的結構，使得內部的色氨酸完全暴露，在堿性環境下發生了熒光猝滅。

圖5 不同脫酰胺度的玉米醇溶蛋白的內源性熒光光譜Fig.5 Typical intrinsic emission fluorescence spectra of zein at different deamidation degree

2.6 紫外吸收

蛋白質產生紫外吸收光譜主要是由于色氨酸和酪氨酸殘基側鏈基團對紫外光的吸收作用，根據蛋白質對紫外光譜吸收的不同，可以預測蛋白質分子在溶液中構象的變化[26]。蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的吸收峰值在280 nm左右。由圖6可以看出，脫酰胺度低(DD=0.89%)時，玉米醇溶蛋白的最大紫外吸收峰大約在280 nm，脫酰胺度高(DD=34.70%)時，吸收強度增加，表明蛋白質內容發色基團暴露在外部，玉米醇溶蛋白更加舒展[27]。紫外吸收強度的變化表明玉米醇溶蛋白結構發生了改變。

圖6 不同脫酰胺度的玉米醇溶蛋白的紫外吸收光譜Fig.6 UV spectra of zein at different deamidation degree

2.7 分子柔性的變化

脫酰胺的過程是將玉米醇溶蛋白中的疏水的谷氨酰胺和天冬酰胺轉變為親水的谷氨酸和天冬氨酸[28]。這種變化增加了玉米醇溶蛋白的親水特性，從而可用作食品加工的表面活性劑或乳化劑[9,28]。紫外吸收光譜的變化和內源性熒光強度的變化均說明脫酰胺改變了玉米醇溶蛋白的結構，可能也改變了玉米醇溶蛋白分子的柔性。利用低脫酰胺度(DD=0.89%)和高脫酰胺度(DD=34.70%)的玉米醇溶蛋白對胰蛋白酶的敏感性表征分子柔性，見圖7。

圖7 脫酰胺度對玉米醇溶蛋白分子柔性的影響Fig.7 The effect of deamidation on the flexibility of zein

脫酰胺度為0.89%時，玉米醇溶蛋白經過胰蛋白酶修飾后在280 nm下的吸光值為0.11，而脫酰胺度為34.70%時，玉米醇溶蛋白經過胰蛋白酶修飾后在280 nm下的吸光值為0.54，說明脫酰胺作用可以增加玉米醇溶蛋白的分子柔性。KATO等研究發現增加蛋白質的柔性可以顯著改善蛋白質的乳化性[18]。

3 結論

與50%～90%的乙醇-水溶液介質相比較，玉米醇溶蛋白在水介質中更容易發生脫酰胺作用。高脫酰胺度(DD=34.70%)玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩定性比低脫酰胺度(DD=0.89%)玉米醇溶蛋白的乳化活性和乳化穩定性分別提高了244.86%和1 055.85%。脫酰胺作用改變了玉米醇溶蛋白的結構和構象，提高了玉米醇溶蛋白分子的柔性，本研究的結果為開發天然乳化劑提供了很好的基料并奠定了理論基礎。