干酪乳桿菌菌體表面物質對凍干存活率的影響

吳晟，崔樹茂，毛丙永，唐鑫，趙建新，張灝，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

益生菌是一類攝入人體后對腸道環境有益的活性微生物[1]，其中乳酸菌屬及雙歧桿菌屬最為常見。干酪乳桿菌屬于革蘭氏陽性菌，常見于發酵蔬菜、發酵乳等食品及人體腸道內[2]，在厭氧或兼性厭氧環境中生長良好。干酪乳桿菌能黏附于腸道上皮細胞進而定植于腸道，并代謝生成短鏈脂肪酸等產物[3-4]，酸化腸道環境，抑制單增李斯特菌[5]、金黃色葡萄球菌[6]、沙門氏菌、大腸桿菌[7]等致病菌的定植；能夠發酵牛奶中的乳糖并制備成酸奶，對于乳糖不耐癥患者是一大福音；干酪乳桿菌對代謝綜合癥的緩解作用也較為顯著[8]。

乳酸菌廣泛的益生功效備受關注，如何高效制備乳酸菌制劑一直被不斷探索，真空冷凍干燥法是目前生產生物活性制劑的主要手段。為了提高凍干后菌株的存活率、單位質量菌粉所含活菌數以及菌粉的貨架期穩定性[9]，各種糖類[10]、蛋白質以及一些小分子化合物[11-13]對菌體的保護作用被深入剖析。已發現糖類的凍干保護效果優于其他類保護劑，且低聚糖對乳桿菌的凍干保護效果最好[14]；亦有研究認為，海藻糖的凍干保護效果最好[15]，它具有低流動性、高黏度和高玻璃轉化溫度，能夠在凍干過程形成玻璃態保護菌體蛋白功能[16]，并且通過氫鍵替代水化層穩定脂質膜和蛋白質結構。

凍干保護劑的使用確實提高了乳酸菌制劑的制備效率，但是很難僅通過優化保護劑進一步提高制備效率。通過提高菌體抗逆性和凍干存活率亦被研究，如酸脅迫、低溫脅迫、滲透壓脅迫等，但是菌體在生長過程中不可避免產生的表面物質對菌體凍干存活的影響一直被忽視。乳酸菌表面物質主要是由莢膜多糖和表面蛋白組成。莢膜多糖依靠糖的多羥基結構與細胞膜表面的磷脂產生氫鍵作用，附著于細胞表面；表面蛋白也是菌體表面物質的一種，包括S層蛋白、膜蛋白、分泌蛋白與其他表面蛋白。已有研究表明，莢膜多糖和表面蛋白對菌體有一定的保護作用，能夠幫助菌體抵御外界的惡劣環境[17-19]。但是菌體表面物質與凍干保護劑對菌體的凍干保護效果是否有差異，在已有高效保護劑的條件下增加或減少表面物質對菌體凍干存活是否有影響，至今均無定論。菌體自身表面物質與細胞膜的結合可能使其較外源添加的保護劑能更有效地保護菌體細胞膜的完整性或流動性，這種結合亦可能影響保護劑對細胞膜的保護。故本研究選擇水蘇糖、海藻糖及菊粉作為凍干保護劑，通過物理剝離和發酵控制的方法探索表面物質的產生及產量對干酪乳桿菌凍干存活的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

干酪乳桿菌17005、干酪乳桿菌173011CQQJ3、干酪乳桿菌PS5-4，來自于江南大學食品生物技術菌種保藏中心，由人類糞便中篩選得到。

1.1.2 試劑

K2HPO4·3H2O、MnSO4·H2O、MgSO4、K2SO4、CuSO4、NaCl、無水乙酸鈉、無水葡萄糖、1水合乳糖、檸檬酸氫二胺、L-半胱氨酸鹽酸鹽、瓊脂粉、H2SO4、無水乙醇、蒽酮，國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉和蛋白胨，蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司；阿拉伯糖、海藻糖、水蘇糖及菊粉，上海創賽科技有限公司；酵母浸粉FM 528，安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

GRP-9080型隔水式恒溫培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；FE20型pH計、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國IKA公司；保興BIOTECH-3000發酵罐，上海保興生物設備(上海)有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；SW-CJ-1CU型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；K1100凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；Telstar Lyobeta 5ps 凍干機，西班牙泰事達公司；超聲破碎儀JY92-IIDN，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的活化及培養

取凍存于-80 ℃的保菌管，接種環蘸取少量菌液后在MRS固體平板劃線純化，置于37 ℃隔水式恒溫培養箱中培養36～48 h，挑取單菌落接種于5 mL MRS液體培養基，37 ℃恒溫培養12～18 h，即得菌株的種子液。

1.3.2 干酪乳桿菌表面物質的剝離

采用物理超聲法對穩定期收集的菌體進行表面物質的剝離[20]，具體操作如下：離心(8 000×g,15 min)收集培養至穩定期的菌體，生理鹽水洗滌兩次，菌泥按照1∶1(g∶mL)重懸于1 mol/L NaCl溶液混勻后，分別置于63、72、81、90 W的功率條件下，冰浴超聲6、12、18 min，超聲前后取樣測定菌懸液中菌體的活菌數，計算超聲后的存活率。

1.3.3 表面物質剝離前后干酪乳桿菌的透射電鏡觀察

按1.3.2中得到的最優條件剝離菌體表面物質后，用體積分數為4%戊二醛前固定，隨后加入1 mg/mL 四氧化鋨后固定，最后用75%乙醇脫水，環氧樹脂包埋，制備超薄切片，乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行切片染色，完成后置于透射電鏡下觀察[21]。

1.3.4 表面物質剝離前后干酪乳桿菌的凍干

離心(8 000×g,15 min)收獲穩定期的菌體后，取4份濕菌泥樣品，每份1 g，分別添加1 mL的生理鹽水、200 g/L水蘇糖溶液、200 g/L海藻糖溶液和200 g/L菊粉溶液，充分混勻后進行凍干；另取4份濕菌泥樣品，每份1 g，按照最優超聲條件剝離表面物質，離心(8 000×g,15 min)收集表面物質被剝離后的菌泥，分別添加1 mL的生理鹽水、200 g/L水蘇糖溶液、200 g/L海藻糖溶液和200 g/L菊粉溶液，并分別用無菌水定容至與未剝離組菌懸液相同體積(確保凍干前剝離組與未剝離組活菌數一致，保護劑濃度和比例一致)，充分混勻后進行凍干。

凍干條件：預凍，控制層板1 h內降溫至-50 ℃，保持4 h；一次干燥，控制層板1.3 h升溫至-30 ℃，保持30 h；二次干燥，控制層板1 h升溫至25 ℃，保持20 h。

1.3.5 凍干樣品的活菌數及存活率計算

將凍干樣品以無菌水復溶至凍干前體積，采用平板菌落計數法進行活菌計數，并根據公式(1)計算凍干存活率：

(1)

1.3.6 干酪乳桿菌表面物質含量的測定

以1.3.2中得到的最優條件剝離菌體表面物質，超聲結束后離心(8 000×g,20 min)取上清液，用于莢膜多糖和表面蛋白的測定。其單位菌體表面物質含量為單位菌體莢膜多糖與表面蛋白含量之和。

莢膜多糖含量的測定采用硫酸-蒽酮比色法[22]：稱取0.2 g蒽酮溶解于100 mL的體積分數為81%的H2SO4，取適量上清液按一定比例稀釋至1 mL，加入4 mL H2SO4-蒽酮溶液，沸水浴10 min后取出并冷卻至室溫，測定OD620，根據公式(2)計算莢膜多糖含量(mg/CFU):

(2)

表面蛋白含量的測定采用凱氏定氮法[23]：稱取3.6 g K2SO4和0.4 g CuSO4作為消化催化劑加至消化管，取1 mL上清液及10 mL濃H2SO4加入消化管，置于石墨爐上消化。消化程序為120 ℃/2 min，180 ℃/2 min，240 ℃/30 min，350 ℃/60 min，420 ℃/60 min，待樣品冷卻至室溫后進行滴定，所得蛋白濃度即為每1 mL上清液中蛋白濃度，根據樣品體積及濃度計算得到樣品的總蛋白濃度，并根據公式(3)計算單位菌體表面蛋白含量(mg/CFU)：

1.3.7 不同發酵條件下菌體表面物質含量測定與凍干

1.3.7.1 不同碳氮比

配制碳氮比為4∶1、4∶3的發酵培養基各3 L，氮源為酵母浸粉FM 528，葡萄糖質量濃度為80 g/L，其余營養成分參考MRS培養基。干酪乳桿菌17005按1.3.1的條件活化后，以體積分數為2%的接種量接種于5 L發酵罐中進行pH6.0、37 ℃恒溫培養，并分別于對數期及穩定期收集菌體，一部分菌泥用于單位菌體表面物質含量的測定，一部分菌泥以質量體積比1∶1(g∶mL)添加200 g/L水蘇糖進行凍干，測定凍干前后活菌數并計算存活率

1.3.7.2 不同碳源

以葡萄糖、阿拉伯糖為碳源，配制2種不同碳源的發酵培養基。其中質量碳源濃度為20 g/L，氮源(酵母浸粉FM 528)質量濃度為15 g/L、無機鹽、微量元素與MRS培養基一致。菌株按1.3.1的條件活化后，以2%接種量接種于5 L發酵罐(裝液量為3 L)，菌株培養及收集方式及凍干條件參考1.3.7.1。

1.3.8 數據統計與分析

每個實驗值的測定均為3次平行實驗的平均值。數據分析采用Graphpad 7.0完成，結果以均值±標準差顯示。顯著性采用T檢驗分析，P<0.05為數據存在顯著性差異。

2 結果討論

2.1 干酪乳桿菌表面物質剝離的最優條件

將菌體重懸于1 mol/L NaCl溶液中，由于高滲透壓作用菌體產生收縮，其表面物質與細胞壁之間的空隙增大，在超聲的空化作用下表面物質更易于破碎溶出[24]。圖1表明在較低功率(63和72 W)時，菌體的活性均不受影響，即使延長超聲時間，菌體活性依然未有損失。超聲功率繼續提高后，不同菌株的耐受性呈現出差異。干酪乳桿菌173011CQQJ3和干酪乳桿菌PS5-4對超聲具有較強的耐受能力，只在90 W功率超聲18 min時存活率有所下降；干酪乳桿菌17005在81和90 W時超聲較短的時間，其活性不受影響，但超聲時間達到18 min，存活率顯著降低。過高的超聲頻率及時間會使菌體破裂，且超聲過程中會由于水分子高速運動不斷釋放熱量，影響菌體活性。為了確保菌體表面物質被完全剝離，在菌體活性保持無損失的前提下采取最大的超聲功率和超聲時間，即干酪乳桿菌17005、干酪乳桿菌173011CQQJ3、干酪乳桿菌PS5-4表面物質剝離條件分別為90 W/6 min、90 W/12 min、90 W/12 min；并通過透射電鏡驗證最優條件處理后的干酪乳桿菌17005表面物質的剝離情況。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-干酪乳桿菌PS5-4圖1 干酪乳桿菌在不同超聲條件下的存活率Fig.1 The survival rate of different L.casei under different ultrasonic conditions注：*表示在P<0.05上具有顯著性差異；**表示在P<0.01上具有顯著性差異；***表示在P<0.001上具有顯著性差異；****表示在P<0.0001上具有顯著性差異(下同)

a-未剝離組; b-剝離組圖2 表面物質剝離前后的干酪乳桿菌形態Fig.2 The morphological characteristics of L.casei before and after the surface material stripped

對比圖2-a及圖2-b發現,剝離組菌體的表面物質被顯著剝離，且視野中的菌體完整無損傷，證實了該方法的可行性及有效性。干酪乳桿菌17005的濕菌泥經過超聲處理后，再離心收集的菌泥濕重約為處理前的70%左右，進一步證實了表面物質被高效剝離；但是處理后干重僅降低7%，即1 g濕菌泥僅有0.015 g的表面物質，也證實了菌體的表面物質可以與培養基中水分子通過氫鍵結合,一方面增加了菌泥的含水量降低菌體收集效率，另一方面這層特殊的結構可能對菌體的凍干存活產生影響。

2.2 表面物質對于菌體凍干存活率及活菌數的影響

2.2.1 無保護劑條件下干酪乳桿菌表面物質剝離前后凍干存活率

為了研究干酪乳桿菌表面物質的凍干保護作用，將表面物質剝離前后的3株干酪乳桿菌重懸于生理鹽水中凍干，其凍干存活率如圖3。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-干酪乳桿菌ps5-4圖3 三株干酪乳桿菌表面物質剝離前后混合生理鹽水的凍干存活率Fig.3 The freeze-drying survial rate of three strains of L.casei with saline solution before and after the surface substance stripped注：NS表示沒有顯著性差異(P<0.05)(下同)

在沒有保護劑的條件下，3株菌的死亡率均超過90%。雖然表面物質未剝離對菌體的凍干存活略有提高，但僅依靠表面物質對菌體的保護作用，不足以降低凍干對菌體造成的損失。為比較單位質量表面物質和單位質量保護劑(水蘇糖或海藻糖)對菌體的保護差異，在菌體表面物質剝離后，將其置于含有與表面物質等量的保護劑溶液中(10 g/L)，但結果表明存活率未有顯著差異(數據結果未列出)。在這種低量的情況下，無論是菌體自身的表面物質，還是保護劑均無法有效保持菌株在凍干過程中的活性。要確保菌株凍干后的活性，依然需要大量的凍干保護劑。但是表面物質均是大分子結構，附著在菌體表面以多種形式與細胞膜結合，其是否會影響保護劑對菌體的凍干保護作用？ DIMOPOULOU等[17]研究酒球菌屬的胞外多糖及凍干存活率關系時總結道，在麥芽糊精與蔗糖作保護劑時，胞外多糖的產生能夠顯著提高酒球菌屬的凍干存活率。因此應該添加保護劑對表面物質及保護劑的保護效果差異進行研究。

2.2.2 以水蘇糖或海藻糖作為保護劑條件下干酪乳桿菌表面物質剝離前后凍干存活率

將剝離表面物質前后的菌體以水蘇糖作為保護劑進行凍干，其凍干存活率如圖4所示。表面物質剝離后3株干酪乳桿菌的凍干存活率均有不同程度的提高。干酪乳桿菌17005、173011CQQJ3及PS5-4未剝離組的存活率分別為(30.46±6.08)%、(23.82±8.68)%、(35.71±3.59)%，而表面物質剝離后存活率分別達到了(49.73±4.51)%、(35.71±3.59)%、(38.89±10.39)%。為了排除剝離過程中1 mol/L 的NaCl溶液對于菌株凍干活性的影響，分別將菌體重懸于1 mol/L的NaCl溶液和生理鹽水中且不進行超聲，靜置半小時后凍干，其凍干存活率如圖5所示，未處理組與高滲處理組的3株干酪乳桿菌凍干存活率無顯著性差異，說明短時間的高滲透壓環境對菌株凍干存活率沒有顯著影響。結果表明在以水蘇糖作為保護劑時，無表面物質的干酪乳桿菌凍干存活率顯著提高。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-干酪乳桿菌ps5-4圖4 三株干酪乳桿菌表面物質剝離前后以水蘇糖為保護劑的凍干存活率Fig.4 The survival rate of three strains of L.casei before and after the surface substance stripped with stachyose as cryoprotectant

圖5 三株干酪乳桿菌高滲透壓處理前后的凍干存活率Fig.5 The freeze-drying survial rate of three strains of L.casei before and after processed in hyperosmotic media

以海藻糖作為保護劑時，得到與水蘇糖作為保護劑一樣的規律。結果如圖6所示，3株干酪乳桿菌在表面物質剝離前后以海藻糖作為保護劑時凍干存活率均有一定的提高，說明在以最適的小分子糖為保護劑時，菌體產生的大分子表面物質會影響小分子糖對菌體的凍干保護。越來越多的證明表明，小分子糖類保護劑與細胞膜的結合，維持其完整性和流動性是菌體減少凍干損失的主要原因。表面物質作為大分子，其在凍干過程中對菌體的保護作用可能不及小分子糖類保護劑，且亦會影響小分子羥基類物質與細胞膜的結合。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-干酪乳桿菌ps5-4圖6 三株干酪乳桿菌表面物質剝離前后以海藻糖為保護劑的凍干存活率Fig.6 The survial rate of three strains of L.casei before and after the surface substance stripped with trehalose as cryoprotectant

2.2.3 以菊粉為保護劑的條件下干酪乳桿菌表面物質剝離前后凍干存活率

菊粉是不同聚合度的大、小分子聚果糖的混合物，相對分子量顯著高于水蘇糖和海藻糖。結果如圖7所示，在以大分子菊粉為保護劑時，3株菌的凍干存活率均較低，且表面物質剝離后，存活率降低。表明在以大分子為保護劑時，菌體表面物質的存在利于對菌的凍干保護。大分子保護劑不像小分子糖類能夠穿透細胞壁，與細胞膜緊密結合，在細胞膜和細胞壁之間形成有效的保護層結果表明。在以小分子糖類為保護劑時，菌體的表面物質作為大分子附著在菌體表面可能影響小分子羥基類物質對菌體的保護；在以大分子多羥基類物質為保護劑時，表面物質因其與菌體更好的結合，體現出較大分子保護劑更優的保護作用。

a-干酪乳桿菌17005; b-干酪乳桿菌173011CQQJ3; c-ps5-4圖7 三株干酪乳桿菌表面物質剝離前后以菊粉為保護劑的凍干存活率Fig.7 The survial rate of three L.casei before and after stripping the surface substance with inulin as cryoprotectant

2.3 干酪乳桿菌表面物質分析

基于2.2中表面物質影響小分子糖對菌體凍干保護的假設，對3株干酪乳桿菌的表面物質成分進行分析測定，結果如圖8所示。3株干酪乳桿菌表面物質中大部分是表面蛋白，多糖僅占很少比例。譚莎莎等[14]研究乳桿菌凍干保護規律時總結羥基類保護劑的凍干保護效果顯著優于蛋白類物質，因羥基基團能夠與菌體細胞膜形成緊密氫鍵結合，保護細胞膜的完整結構；且海藻糖和水蘇糖在凍干過程中能夠形成高黏度、低流動的玻璃態介質，當蛋白質水化層被破壞后，代替水化層保護蛋白質的功能；而大分子的蛋白類物質起不到該方面的保護作用，表面物質的高蛋白可能是其影響水蘇糖和海藻糖凍干保護效果的主要原因。

圖8 干酪乳桿菌單位菌體糖含量及蛋白含量Fig.8 The polysacharide and protein content of L.casei

2.4 不同發酵條件對菌株表面物質的產量及凍干存活的影響

為了進一步驗證表面物質含量與菌體凍干存活率的關系，以干酪乳桿菌17005作為研究對象，通過改變發酵條件探索表面物質產量與干酪乳桿菌的凍干存活率的關系，分別從培養基的碳氮比，碳源種類2方面進行分析。

2.4.1 不同碳氮比發酵對菌株表面物質及凍干存活率的影響

有研究表明，過高的碳氮比會增加微生物胞外多糖的產生[25]。因此，以高碳氮比和低碳氮比分別培養干酪乳桿菌17005，分析對數期和穩定期菌體的表面物質的產生和凍干存活率。結果如表1所示，在對數生長期(8 h)高碳氮比培養的干酪乳桿菌17005較低碳氮比產生更多的表面物質，且進一步影響了菌體的凍干存活率，較低的表面物質的產生利于對數期菌體的凍干存活。但是在穩定期(14 h)收集的菌體，雖然高碳氮比較低碳氮比亦產生較多的表面物質，凍干存活率卻無顯著性差異。且穩定期收集的菌體比對數期的菌體產生更多的表面物質，而凍干存活率并未降低。說明在穩定期培養環境的饑餓脅迫和高滲脅迫(80 g/L碳源發酵結束環境滲透壓較高)提高的菌體抗逆性是除保護劑之外保持菌體凍干活性的主要因素[26]，表面物質產生的多少并不會顯著影響穩定期菌株的凍干存活率。

表1 干酪乳桿菌17005單位菌體表面物質含量及凍干存活率Table 1 The content of surface substance of each L.casei 17005 cell and its freeze-drying survival rate

2.4.2 不同碳源發酵對菌體的表面物質含量及凍干存活率的影響

碳源的種類會顯著影響莢膜的產生，戊糖無法被乳酸菌磷酸化生成6-磷酸葡萄糖參與莢膜合成途徑[27]，阿拉伯糖是戊糖，較葡萄糖產生更少的表面物質(表2)。在對數期，阿拉伯糖培養的菌體表面物質含量顯著低于葡萄糖培養的菌體，其凍干存活率亦與表面物質含量呈負相關，與不同碳氮比發酵培養形成的結果一致。但在穩定期，菌體的凍干存活率與表面物質的關系與2.4.1的結果相反，這可能是該組實驗采取的是20 g/L的碳源，發酵結束培養環境的滲透壓并未達到對菌體產生滲透脅迫的條件，且阿拉伯糖的利用效率低，發酵12 h依然有阿拉伯糖尚未完全利用，此時菌體未受到的饑餓和高滲脅迫，表面物質對菌體凍干存活的影響是主要因素；且表面物質的含量超過一定量(單位菌體表面物質含量>1.6×10-10mg/CFU)時，其對水蘇糖的保護效果的影響不再變化。因此，在不受到其他脅迫影響的條件下，干酪乳桿菌菌體的凍干存活與表面物質的產生呈負相關，表面物質產生的越多，越會降低水蘇糖對菌體的凍干保護。

表2 不同碳源發酵后干酪乳桿菌17005單位菌體表面物質含量及凍干存活率Table 2 The content of surface substance of each L.casei 17005 cell under different carbon sources fermentation conditions and freeze-drying survival rate

3 結論

干酪乳桿菌的表面物質包括表面蛋白與莢膜多糖，且表面蛋白含量顯著高于多糖含量。表面物質被剝離后，以海藻糖或水蘇糖作為保護劑時菌體的凍干存活率顯著提高，表面物質的過量產生會降低糖類對菌體的凍干保護作用。以阿拉伯糖作為底物碳源相較于葡萄糖可有效減少菌體表面物質的產生，提高菌體以水蘇糖或海藻糖作為保護劑時的凍干存活率；降低發酵過程的碳氮比亦均可有效減少干酪乳桿菌表面物質的產生，進而提高對數期菌體以水蘇糖或海藻糖作為保護劑時的凍干存活率。