代謝多種低聚糖乳酸菌的篩選鑒定及其部分益生特性研究

林麗，鄧倩，羅琳，康渝接，嚴唯瑋，何利，敖曉琳，劉書亮

(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625014)

人體腸道菌群是一個復雜的微生態系統，對宿主生理的許多方面都有影響，如疾病發展、藥物代謝和免疫系統的調節等[1]。其中，乳酸菌因能產生乳酸并抑制腸道中有害微生物的生長，對宿主健康產生有益作用，被認為是一類益生菌[2]。人體腸道菌群的組成受多種因素的影響，其中飲食是一種重要的環境因素。CARMODY 等[3]研究認為飲食在形成宿主相關微生物群落個體差異中起主導作用。隨含益生元的飲食攝入，通過增加特定細菌的數量來顯著調節腸道菌群結構[4]，可促進宿主腸道健康。國內外已有大量研究表明，低聚糖作為一種益生元，不易被腸道消化，能顯著增殖部分乳酸菌和雙歧桿菌[5-8]。菊粉、低聚果糖和低聚木糖、低聚異麥芽糖是4種重要的功能性低聚糖, 也是目前應用較為廣泛的益生元。

近年來，國內外有一些關于乳酸菌代謝功能性低聚糖的研究，如王苗等[9]發現其實驗中有4 株乳酸菌均能夠優先利用魔芋甘露低聚糖中的聚合度≤3的組分進行生長和發酵產酸。BANUELOS等[10]實驗表明，產氣乳酸桿菌CECT5714和發酵乳桿菌CECT5716能在低聚果糖培養基中生長。但這些研究多以探究特定的低聚糖對特定菌株的生長影響為主，缺乏菌株對不同種類低聚糖廣譜性利用的報道。有文獻指出在完全不可控的環境條件下，通過食品的自然發酵可以獲得豐富的益生菌資源[11]。因此，本文擬探究食品源乳酸菌對多種低聚糖的廣譜性利用情況，篩選出能高效代謝多種低聚糖的菌株，對其鑒定和益生特性研究，為益生菌劑和合生元產品的開發提供菌種資源和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

實驗菌株：四川臘肉源乳酸菌55株、四川泡菜源乳酸菌20株以及生牛乳源乳酸菌35株，藥敏實驗質控菌株為大腸桿菌(E.coliATCC 25922)，由四川農業大學食品微生物實驗室提供。

主要試劑：低聚果糖(純度95%)，河南素荷生物科技有限公司；低聚木糖(純度99%)，浙江一諾生物科技有限公司；菊粉(純度95%)，英博生物科技有限公司；低聚異麥芽糖(純度99%)，河南萬邦實業有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽(純度99%)，源葉生物有限公司；胃蛋白酶(BR)、胰蛋白酶(BR)，上海瑞永生物科技有限公司；三號膽鹽(BR)，上?；瘜W試劑站分裝廠；HBIG11乳酸菌生化鑒定條、MRS合成培養基，青島海博生物技術有限公司；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司。

Basal MRS培養基(500 mL)：蛋白胨5 g；酵母抽提物2.5 g，檸檬酸銨1 g，醋酸鈉2.5 g,MgSO450 mg；MnSO412.5 mg,K2HPO41 g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.25 g,吐溫-80 500 μL。

MRS固體培養基(1 L)：MRS合成培養基55 g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g,瓊脂18 g,CaCO315 g。

MRS液體培養基(1 L)：MRS合成培養基55 g,L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g。

1.1.2 主要儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋(HWS24型)，上海一恒科技有限公司；pH計(PHSJ-3F型)，上海儀電科學儀器股份有限公司；電泳儀(DYY-6D型)，北京市六一儀器廠；PCR儀(T100型)、凝膠成像儀(Gel Doc XR型)，Bio-Rad。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化

實驗菌株采用體積分數為50%的甘油于-20 ℃保存。實驗時平板活化后挑取單一菌落接種于MRS液體培養基，37 ℃靜置培養 24 h，連續轉接2次，將最后1次培養液采用4 ℃、8 000 r/min離心10 min，得菌體沉淀，然后用無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀2次，再用相同體積的無菌生理鹽水重懸得到乳酸菌細胞懸液，備用。

1.2.2 代謝低聚糖乳酸菌菌株的篩選

1.2.2.1 代謝低聚糖乳酸菌菌株的初篩

配制Basal MRS培養基，并加入溴甲酚紫(終質量濃度0.03 g/L)，實驗組分別加入10 g/L的低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖和菊粉，陽性對照組加入10 g/L葡萄糖，陰性對照組在培養基中加入體積分數為1%的水，滅菌待用。將上述活化的菌株按體積分數為2%的接種量接種于上述3組培養基中，于37 ℃ 培養觀察，顏色變黃者即為陽性。

1.2.2.2 代謝多種低聚糖乳酸菌菌株的復篩

配制Basal MRS培養基，分別加入10 g/L低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖和菊粉，滅菌待用。將可代謝4種低聚糖的菌株活化后以體積分數2%接種量接種于上述培養基中，在37 ℃ 培養箱中培養24 h后，取1 mL發酵液采用平板法計數。選取平板菌落數較高的菌株作為后續研究菌株。

1.2.3 代謝多種低聚糖乳酸菌菌株的鑒定

1.2.3.1 菌落形態與細胞形態觀察

用接種環取1環菌懸液，劃線于MRS平板，37 ℃培養24 h后，觀察菌落特征。挑取單菌落，經革蘭氏染色，在生物學顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.3.2 生理生化鑒定

采用乳酸菌生化鑒定條對實驗菌株進行生理生化鑒定，包括七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖、蔗糖和乳糖的發酵實驗。

1.2.3.3 16S rDNA 序列測定

采用細菌基因組提取試劑盒對實驗菌株的基因組DNA進行提取，以實驗菌株的基因組DNA為模板，利用通用引物7F：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和1540R：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′進行PCR擴增，將PCR擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳驗證純度，割膠回收目的片段，送成都擎科梓熙生物有限公司完成序列測定，最后將測得的16S rDNA基因序列在NCBI上注冊并進行Blast比對，并利用MAGE5.0軟件構建系統發育樹。

1.2.4 代謝多種低聚糖乳酸菌的益生特性研究

1.2.4.1 單種低聚糖添加量對乳酸菌生長的影響

配制Basal MRS培養基，加入低聚糖并使質量濃度分別達到0、10、30、50和70 g/L，將配制好的培養基滅菌待用。取活化后的菌株以體積分數2%接種量接種于上述培養基中，37 ℃靜置培養24 h后測定發酵液OD600值，比較不同含量低聚糖以及不同種類低聚糖對乳酸菌生長的影響。

1.2.4.2 生長曲線的測定

根據1.2.4.1實驗結果，分別選取1種低聚糖作為實驗菌株的最佳低聚糖并確定濃度，在Basal MRS培養基中分別加入菌種的最佳低聚糖和葡萄糖，靜置培養，0～5 h時，每隔1 h取出發酵液，5～13 h時，每隔2 h取出發酵液測定，13～37 h時，每隔4 h取出發酵液測定OD600值，測定乳酸菌生長曲線。

1.2.4.3 pH耐受性試驗

將活化后的菌株以體積分數2%接種量分別接種到pH 2.0、3.0、4.0和5.0的MRS液體培養基中，37 ℃水浴振蕩培養2 h，在0、2 h取樣，采用平板法計數，同時做平行試驗。

1.2.4.4 膽鹽耐受性試驗

將活化后的菌株以體積分數2%接種量分別接種于質量濃度為1、2和3 g/L膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃水浴振蕩培養2 h，分別在0、2 h時取樣，采用平板法計數，同時做平行試驗。

1.2.4.5 模擬胃腸道耐受性試驗

耐人工胃腸液試驗：分別取1.0 mL菌懸液與9.0 mL人工胃液和人工腸液混合后，放入37 ℃水浴鍋振蕩培養，分別在0、2 h取樣，采用平板計數法測定活菌數，同時做平行實驗。

人工胃液：取16.4 mL稀HCl (1 mol/L)，加約800 mL蒸餾水與10 g胃蛋白酶，充分混勻溶解，加水定容至1 000 mL，調pH至2.5，用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌。使用前37 ℃預熱。

人工腸液：將胰腺液和膽液以2∶1的體積比混合均勻，得到人工腸液。使用前37 ℃預熱。

胰腺液：1 g/L胰蛋白酶、11 g/L NaHCO3、2 g/L NaCl，將pH調8.0后，用0.22 μm無菌微孔膜過濾除菌。

膽液：9 g/L膽鹽，將pH調整到8.0后，用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾除菌。

1.2.4.6 藥敏試驗

采用K-B法[12]對實驗菌株進行藥敏性試驗。調整菌體濁度為0.5麥氏單位，用無菌棉簽均勻涂布MRS固體培養基表面，用無菌鑷子取藥敏紙片貼于培養基表面。培養48 h后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，藥敏實驗使用E.coliATCC 25922作為質控菌株。藥敏紙片包括慶大霉素、紅霉素、四環素、氯霉素、鏈霉素、利福平和環丙沙星。同時做平行試驗。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 可代謝低聚糖乳酸菌菌株情況

測試的110株乳酸菌在初篩時對低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖和菊粉的代謝情況見表1。由表1可知，僅有8株乳酸菌不能代謝實驗中的4種低聚糖。四川臘肉源55株乳酸菌中有38株、四川泡菜源20株乳酸菌中有17株、而生牛乳源35株乳酸菌中僅有8株可以代謝4種低聚糖，合計有63株乳酸菌對低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖和菊粉均有代謝能力，為代謝低聚糖益生菌篩選提供了重要菌源。

表1 乳酸菌對不同低聚糖的代謝情況Table 1 Metabolism of different oligosaccharides by lactic acid bacteria

以可利用4種低聚糖的菌株進行復篩試驗，選擇菌落計數結果最多的生牛乳源菌株SNR24、四川臘肉源菌株RP30和四川泡菜源菌株PC140 三株菌作為后續實驗菌株。這3株菌的復篩試驗結果見表2，其在以4種低聚糖為唯一碳源的培養基中良好生長，活菌數可達109CFU/mL左右。

表2 三株菌于不同低聚糖培養基中的生長情況 單位：lg(CFU·mL-1)Table 2 Growth of three strains in different oligosaccharide media

2.2 代謝多種低聚糖乳酸菌菌株的鑒定

將2.1小節中篩選得到的3株乳酸菌在MRS培養基上劃線培養，菌落形態如圖1所示，3株菌的菌落形態呈近圓形，乳白色，表面濕潤，無褶皺，中間突起，邊緣整齊。經革蘭氏染色后，其細胞形態為革蘭氏陽性、短桿狀、無芽孢，如圖2所示。

a-菌株SNR24; b-菌株RP30; c-菌株PC140圖1 三株乳酸菌的菌落形態圖Fig.1 Colony morphology of three lactic acid bacteria strains

a-菌株SNR24; b-菌株RP30; c-菌株PC140圖2 三株乳酸菌的細胞形態圖(1 000×)Fig.2 Cell morphology of three lactic acid bacteria strains

3株乳酸菌的生理生化鑒定結果見表3，可根據《伯杰氏系統細菌學手冊》[13]對菌株進行鑒定，但最終鑒定結果還應結合形態學分析、16S rDNA序列分析結果來確定。

表3 三株乳酸菌的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of three lactic acid bacteria strains

將菌株SNR24、RP30和PC140的16S rDNA基因經PCR擴增及其產物電泳后回收測序，其測序結果提交 GenBank 數據庫注冊，登錄號分別為MN602938、MN602939和MN602940。通過在NCBI數據庫進行Blast比對，菌株SNR24與Lactobacillusfermentum同源性為100%，菌株RP30、PC140與Lactobacillusplantarum同源性為100%?；?6S rDNA測序結果的系統發育樹如圖3所示。結合形態學、傳統生理生化和16S rDNA 基因序列分析可知，菌株SNR24被鑒定為發酵乳桿菌，菌株RP30、PC140被鑒定為植物乳桿菌。

圖3 三株乳酸菌基于16S rDNA繪制的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of three lactic acid bacteria strains based on 16S rDNA

2.3 代謝多種低聚糖乳酸菌的益生特性

2.3.1 低聚糖不同添加量對乳酸菌生長的影響

不同含量的各種低聚糖對菌株SNR24、RP30和PC140生長的影響如圖4所示。菌株SNR24、RP30和PC140在未添加低聚糖對照組的OD600值分別為0.036、0.034和0.025，而添加了低聚糖實驗組的OD600值>0.2，呈顯著性差異(P<0.05)，表明菌株SNR24、RP30和PC140均能代謝低聚木糖、低聚果糖、低聚異麥芽糖和菊粉。隨著部分低聚糖添加量的增加，發酵液OD600值并非一直遞增，說明低聚糖添加量與發酵液OD600并非呈現線性增長關系。試驗結果表明，菌株SNR24、RP30和PC140的最適宜低聚糖及添加量分別為50 g/L菊粉和30 g/L低聚異麥芽糖、50 g/L菊粉。

a-菌株SNR24; b-菌株RP30; c-菌株PC140圖4 低聚糖添加量對3株乳酸菌生長的影響Fig.4 Effect of oligosaccharide addition on the growth of three lactic acid bacteria strains

2.3.2 三株乳酸菌生長曲線

根據2.3.1結果，以50 g/L的菊粉作為唯一糖源的培養基分別培養菌株SNR24和PC140，以30 g/L的低聚異麥芽糖作為唯一糖源的培養基培養菌株RP30，并以相同質量濃度的葡萄糖作為對照組，繪制生長曲線。如圖5所示，這3菌珠在低聚糖的Basal MRS中生長曲線與在葡萄糖的Basal MRS中生長曲線基本一致；3株乳酸菌在最初培養的3 h內生長緩慢為生長延滯期，之后開始進入對數生長期，菌株SNR24在培養11 h后開始進入穩定期，而菌株RP30和PC140在培養13 h后才進入穩定期。在相同的條件下培養達到穩定期后，菌株RP30和PC140發酵液的OD600值顯著>菌株SNR24。

a-菌株SNR24; b-菌株RP30; c-菌株PC140圖5 三株乳酸菌生長曲線Fig.5 Growth curve of three lactic acid bacteria strains

2.3.3 三株菌的耐酸性

人體胃液pH通常在3.0左右, 空腹和食用酸性食品可達1.5, 食用堿性食物可達4.0～5.0, 且食物 (尤其是流體) 通過胃的時間相對較短, 一般1～2 h。乳酸菌作為益生菌必須具備相對較好的耐酸性[14]。以0 h時乳酸菌活菌數為對照，乳酸菌經不同pH處理2 h后活菌數結果如圖6所示。由圖6可知，3株乳酸菌對pH分別為5.0、4.0和3.0的環境均有較好的耐受能力。但3株乳酸菌對pH 2.0環境的耐受能力較差，經處理后，菌株SNR24、RP30和PC140的活菌對數值分別下降了2.30、2.93和3.40。

圖6 不同酸度環境對3株乳酸菌存活的影響Fig.6 Effect of different acidity environment on the survival of three lactic acid bacteria strains

2.3.4 三株菌的膽鹽耐受性

人體小腸的膽鹽質量濃度一般在0.3～3 g/L，可以在細胞外產生高滲透壓，對菌體細胞造成影響[15]。以0 h時乳酸菌活菌數為對照，乳酸菌經不同膽鹽含量處理2 h后活菌數結果如圖7所示。由圖7可知，3株乳酸菌對質量濃度1和2 g/L膽鹽耐受能力較好，經質量濃度2 g/L膽鹽處理2 h后，菌株SNR24、RP30和PC140的活菌對數值分別下降了1.56、1.46和1.53。3株菌對質量濃度3 g/L膽鹽的耐受能力較差，經處理后，菌株SNR24、RP30和PC140的活菌對數值分別下降了4.19、3.66和4.05。

圖7 不同膽鹽含量對3株乳酸菌存活的影響Fig.7 Effect of different bile salt concentration on the survival of three lactic acid bacteria strains

2.3.5 三株菌的模擬胃腸道耐受性

由表4可知，經人工胃液和人工腸液處理2 h后，3株乳酸菌的活菌數均有所下降，但下降的數量<一個數量級，說明這3株乳酸菌對人工模擬的胃腸道環境均有較好的耐受能力。其中菌株SNR24對人工胃液的耐受能力最強，存活率達71.23%，但對人工腸液的耐受能力最弱，存活率僅有16.15%。菌株RP30在經過人工胃液和人工腸液處理后，其活菌率>50%。綜合來看，菌株RP30對人工模擬胃腸液的耐受性最強。

表4 三株乳酸菌經人工胃腸液處理后活菌數及其存活率Table 4 The number and survival rate of three lactic acid bacteria strains treated with artificial gastrointestinal fluid

2.3.6 三株菌對常見抗生素的藥敏性

表5為抑菌圈直徑判斷標準[16]及乳酸菌藥敏試驗結果，質控菌株ATCC 25922對抗生素產生的抑菌圈直徑均在質控范圍內，因此實驗測得的數據可信。由表5可知，3株乳酸菌對大環內酯類抗生素紅霉素、氯霉素類抗生素氯霉素和安沙霉素類抗生素利福平均敏感，而對氨基糖苷類抗生素鏈霉素、喹諾酮類抗生素環丙沙星均有耐藥性。對于氨基糖苷類抗生素慶大霉素，菌株SNR24中度敏感，而菌株RP30和PC140為耐藥。對于四環素類抗生素四環素，菌株SNR24敏感性，而菌株RP30和PC140為耐藥。

表5 抑菌圈直徑判斷標準及3株乳酸菌藥敏試驗結果Table 5 Criterion for inhibitory result and antibiotic resistance results for three lactic acid bacteria strains

3 結論與討論

本實驗測試了110株乳酸菌對低聚木糖、低聚異麥芽糖、低聚果糖和菊粉的代謝情況，其中四川臘肉源38株、四川泡菜源17株和生牛乳源8株乳酸菌都可以代謝4種低聚糖，發酵食品如臘肉和泡菜源乳酸菌利用低聚糖的能力強于生牛乳源，不同來源乳酸菌對低聚糖的代謝能力存在差異。劉思思[17]篩選得到11株對低聚果糖和低聚木糖均有代謝能力的乳酸菌，其中有8株為分離自發酵食品的植物乳桿菌；IGNATOVA等[18]從乳制品中分離到18 株對低聚果糖和低聚半乳糖均有代謝能力的保加利亞乳桿菌；而毛丙永[19]從人體糞便中僅篩選出2株對低聚果糖有代謝能力的乳酸菌，且不能同時代謝乳酮糖。綜上所述，相較于人體腸道來源乳酸菌而言，來源于發酵食品源中乳酸菌代謝低聚糖能力較強和具有廣譜性，為篩選代謝低聚糖乳酸菌提供了重要菌源。

乳酸菌對抗生素的抗性可能是固有的，也可能是獲得的。若乳酸菌的耐藥性基因是由質粒編碼的，則其耐藥性基因可以在系統發育中遠緣細菌間轉移，這致使乳酸菌作為益生菌使用存在著潛在的危險性[20]。通常研究認為諸多乳桿菌(如干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等)以及雙歧桿菌均具有對萬古霉素有耐藥性，且被認為是一種固有耐藥性[21]。JACOBSEN等[22]通過小鼠體內實驗發現從發酵香腸中分離的L.plantarumDG 522和L.plantarumDG 507通過質粒將抗性基因tet(M)、erm(B)轉移至E.faecalisJH2-2。因此，對于本實驗篩選獲得的菌株是否具有獲得性耐藥基因也可以通過全基因組序列分析做進一步的安全評價。

近年來許多文獻表明，乳酸菌對低聚糖的代謝機制具有菌種特異性，并存在多種轉運機制，且其對不同聚合度低聚糖的代謝能力也并不相同[23]。ROSSI等[24]探究了55株雙歧桿菌對菊粉的利用情況，發現短果聚糖先消失后長果聚糖逐漸消耗，OSE等[25]在相關實驗中也觀察到類似現象。本實驗獲得的發酵乳桿菌和2株植物乳桿菌均能強烈代謝4種低聚糖，具有良好的益生特性，具有益生菌開發的潛質，在后續工作中還應加強其安全評價及低聚糖代謝機制的深入研究。