高產L-乳酸副干酪乳桿菌對酸菜品質及安全性的影響

劉曉輝, 李楊, 敖靜, 高曉梅, 孫玉祿

(遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽，122000)

酸菜是我國北方傳統的加工蔬菜,以白菜為原料,通過微生物發酵得到，不僅保留了白菜原有的營養成分如Vc、膳食纖維等[1],而且還含有乳酸菌等功能性微生物。但傳統酸菜發酵慢、酸味弱，受環境情況響較大，產品質量不穩定，易積累亞硝酸鹽[2-3]，發酵產物多為D-乳酸。由于人體只有代謝L-乳酸的L-乳酸脫氫酶，所以只能吸收L-乳酸，不能吸收D-乳酸，D-乳酸在人體內堆積對人體健康非常有害，帶來了較大的食品安全問題。世界衛生組織提倡在食品及醫藥行業中使用L-乳酸取代D-乳酸，還明確規定，人體每天攝取D-乳酸的量限制在每1 kg體質量100 mg 以下[4]。

L-乳酸菌酸菜是由人工接種高產L-乳酸的副干酪乳桿菌發酵白菜獲得,L-乳酸酸菜可以改善酸菜品質，首先其發酵產物是人體可以利用并對人體有益的L-乳酸，然后因為乳酸菌在代謝過程中可以生成有抑菌活性的多肽，能有效抑制雜菌生長、減少亞硝酸鹽產生、縮短生產周期等[5]，成品酸菜中Vc含量高于傳統發酵酸菜。高含量的VC在一定程度上也會降低亞硝酸鹽的形成速度[6]，從而進一步提高酸菜品質。

本試驗通過比較L-乳酸酸菜與傳統酸菜發酵過程中感官評價、部分理化指標、微生物指標變化情況，得到改善酸菜品質和安全性的生產方法，為提升酸菜質量和改進生產工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

乳酸菌菌種：副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)，本實驗室保藏。

1.1.2 原料

白菜：超市購買。

1.1.3 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、瓊脂、溴甲酚綠、檸檬酸銨、乙酸鈉、MgSO4、MnSO4、K2HPO4、亞鐵氰化鉀、乙酸、鹽酸萘乙二胺、硼砂、對氨基苯磺酸、濃HCl、乙酸鋅，均為分析純；D/L-乳酸檢測試劑盒(D/L-Lactic Acid Assay Kit)，朝陽運丞商貿有限公司。

1.1.4 MRS培養基(g/L)

牛肉膏10，蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖10，乙酸鈉5， 檸檬酸三銨2，吐溫80 1，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，pH自然。分裝到500 mL三角瓶，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

1.1.5 菌種

把4 ℃保藏的副干酪乳桿菌菌種活化后接入MRS培養基中，放置培養箱中32 ℃培養24 h，轉化2代，鏡檢無雜菌則可備用。

1.1.6 儀器與設備

恒溫培養箱(SHP-150)，上海精宏設備有限公司；分光光度計(722 s)，上海精密儀器儀表有限公司；超凈工作臺(SA-900-1JZ)，上海一恒科技有限公司；電子天平(JA2103N)， 上海精密科學儀器有限公司；小號缸、各種玻璃儀器等，朝陽運丞商貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵酸菜的制備

將白菜除爛葉后，用清水沖洗干凈，把白菜擺放在小號缸中，每缸放10 kg,其中2個缸加10 L 20 g/L鹽水即為傳統酸菜,另外2個缸加10 L 20 g/L鹽水和200 mL副干酪乳桿菌菌種即為L-乳酸酸菜，壓實，封口,每種設2個平行樣，取2個平行樣的平均值。

1.2.2 對感官評價的影響[7]

10位專業人員通過觀察發酵液、成品酸菜色澤、聞氣味和脆度得出感官評價結果。

1.2.3 對理化指標的影響[8-10]

1.2.3.1 總酸測定[11-13]

按照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》執行。吸取酸菜汁10 mL于200 mL三角瓶中，加入25 mL蒸餾水，滴入酚酞指示劑2滴，用NaOH標準溶液滴定至粉紅色，并能保持30 s不褪色為止，記錄NaOH用量。

1.2.3.2 亞硝酸鹽測定[14-17]

按照GB/T 5009.33—2010《鹽酸萘乙二胺法》執行。將酸菜用研缽研碎，稱取5.0 g試樣，置于200 mL燒杯中，加入12.5 mL飽和硼砂液，攪拌均勻，用300 mL 70 ℃左右的水將試樣洗入500 mL容量瓶中,于沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫后，加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液混勻，再加入5 mL乙酸鋅溶液混勻以沉淀蛋白質，加水至刻度，混勻，放置0.5 h，除去上層脂肪，清液用濾紙過濾，棄初濾液30 mL，收集剩余濾液備用。吸取40 mL上述處理液于50 mL帶塞比色管中，加入2 mL對氨基苯磺酸溶液混勻，避光靜置5 min，再加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液混勻，加水至刻度，靜置15 min，用2 cm比色杯于538 nm波長處測吸光值，同時以等量的蒸餾水代替樣品液，按同樣的處理方法做空白對照實驗。

1.2.3.3 Vc含量的測定[18]

按照GB 5009.86—2016《食品安全國家標準食品中抗壞血酸2.6-二氯靛酚滴定法》執行。稱取切碎的酸菜樣品20.00 g放在研缽中，加少許質量濃度為20 g/L草酸溶液研碎，倒入200 mL容量瓶中，加質量濃度為20 g/L草酸溶液至刻度，用離心機離心沉淀后過濾備用。吸取10 mL濾液于燒杯中，用2.6-二氯靛酚鈉鹽溶液滴定至桃紅色20 s不褪色，記下染料的用量。吸取質量濃度為20 g/L草酸溶液，用染料作空白滴定記下用量。

1.2.3.4L-乳酸測定[19-20]

按照D/L-乳酸檢測試劑盒(D/L-Lactic Acid Assay Kit)步驟檢測。酸菜汁離心，必要時進行稀釋，使L-乳酸質量濃度為0.003～0.30 g/L之間；溫育到25 ℃備用。

1.2.4 對微生物指標的影響[21-26]

菌落總數GB 4789.2—2016《食品微生物菌落總數的測定》執行；乳酸菌培養及計數按GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物檢驗 乳酸菌檢驗》執行；霉菌和酵母菌計數按GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》執行；大腸菌群計數按GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸桿菌計數》執行。

2 結果與分析

2.1 感官評價影響

由表1可知，傳統發酵酸菜汁渾濁，沒有發酵酸菜的香味，是因為傳統酸菜發酵初期酸度低，腐敗細菌生長繁殖，使白菜組織蛋白質及含氮物質遭到破壞，使發酵液變渾濁，同時，初期有少量霉菌，霉菌分泌分解果膠的酶，使蔬菜組織變軟，導致酸菜脆度變軟。L-乳酸酸菜發酵液清澈，具有酸菜的香氣，是因為L-乳酸酸菜中人工接種的副干酪乳桿菌在發酵初期就產生大量L-乳酸，不但能夠抑制有害微生物的生長，而且由于總酸含量高，致使果膠含量增加，酸菜的脆性更好，賦予酸菜酸度適中、醇香爽脆的獨特風味。所以相對于傳統酸菜，接入副干酪乳桿菌的L-乳酸酸菜感官品質更好。

表1 感官評價Table 1 Result of sensory scoring

2.2 理化指標的影響

2.2.1 總酸的影響

由圖1可知，在整個發酵過程中，2種酸菜的總酸都呈現先上升后微上升的趨勢，這是由于后期大量的乳酸積累，從而進入過酸階段，導致乳酸菌群受到了抑制，酸菜的總酸含量上升減慢。但L-乳酸酸菜的總酸含量上升的幅度要比傳統酸菜快，L-乳酸酸菜在第11天就能達到成熟，酸度為1.2%(pH 3.5)，而傳統酸菜在第20天達到成熟。此試驗得出L-乳酸酸菜比傳統酸菜提前9 d成熟，節約近一半的時間，大大縮短生產周期。

2.2.2L-乳酸含量影響

由圖1可知，L-乳酸酸菜中L-乳酸質量濃度隨發酵時間延長而增加，后來由于大量的乳酸積累，進入過酸階段，導致乳酸菌受到了抑制，15 d后酸度基本維持不變，L-乳酸質量濃度基本保持平穩。傳統酸菜中基本檢測不到L-乳酸，結果表明，接入副干酪乳桿菌可以使酸菜中含有大量對人體有益的L-乳酸，提高了酸菜的品質。

圖1 總酸和L-乳酸含量隨時間變化Fig.1 The total acid and the L-lactic acid changes over time

2.2.3 Vc含量影響

由圖2可知，在整個發酵過程中，L-乳酸酸菜和傳統酸菜中Vc含量都隨發酵時間延長而降低。但L-乳酸酸菜中Vc的含量始終高于傳統酸菜。有研究表明Vc能在一定程度上抑制或減少亞硝酸鹽形成，所以Vc含量增高不但提高了L-乳酸酸菜的品質，也增加了L-乳酸酸菜的安全性。

圖2 亞硝酸鹽和VC含量隨時間變化Fig.2 The nitrite and the VC changes over time

2.2.4 亞硝酸鹽影響

由圖2可知，L-乳酸酸菜中亞硝酸鹽含量在發酵全程均低于傳統酸菜，而且含量一直很低，遠遠低于醬腌菜國標限值(GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》醬腌菜中亞硝酸鹽含量20 mg/kg)，沒有亞硝酸鹽峰值出現。而傳統酸菜在第6天達到峰值28.78 mg/kg，到第14天符合醬腌菜標準。這首先因為L-乳酸酸菜中乳酸菌數量高，產酸多，在一定程度上抑制有害菌及還原性細菌的生長繁殖，從而降低亞硝酸鹽的含量；其次因為乳酸菌在代謝過程中可以產生有抑菌活性的多肽或多肽前體物質，也能高效抑制雜菌繁殖、降低亞硝酸鹽含量。結果表明，傳統酸菜在6～14 d時亞硝酸鹽含量較高，而接入副干酪乳桿菌的L-乳酸酸菜不存在亞硝酸鹽超標問題，能更好地控制亞硝酸鹽含量，提高酸菜安全性。

2.3 微生物指標

2.3.1 總菌落影響

由圖3可知，2種酸菜在發酵過程中總菌落數都隨時間延長而下降；由于L-乳酸酸菜產酸快而多，總酸高，能更好地抑制雜菌的生長繁殖，總菌落數始終比傳統酸菜少，安全性更高。

2.3.2 乳酸菌數量影響

由圖3可知，在整個發酵過程中L-乳酸酸菜乳酸菌數量始終高于傳統酸菜，在第12天達到最高，之后緩慢下降最后趨于不變；傳統酸菜在測試的第21天乳酸菌數達到最高。L-乳酸酸菜由于接種副干酪乳桿菌的菌種優勢，乳酸菌生長繁殖快。結果與總酸含量變化吻合。

2.3.3 霉菌數量影響

由圖3可知，在整個發酵過程中傳統酸菜中霉菌數量較多，隨著發酵時間延長，大量乳酸的產生，抑制了部分霉菌的生長，在發酵結束時有少量霉菌存在；L-乳酸酸菜發酵在開始時霉菌就受到抑制，數量較低，到6 d后檢測不到霉菌。說明L-乳酸酸菜能更好地抑制霉菌生長繁殖，提高酸菜的安全性。

2.3.4 酵母菌數量影響

由圖3可知，在整個發酵過程中L-乳酸酸菜中酵母菌數量始終低于傳統酸菜。在L-乳酸酸菜發酵過程中由于酸度大，有效抑制了酵母菌繁殖，尤其是發酵后期酵母菌數量大量減少。

圖3 微生物指標隨時間變化Fig.3 Microbiological indexes changes over time

2.3.5 大腸菌群影響

在整個發酵過程中，2種酸菜中均未檢出大腸菌群。

3 結論

接入副干酪乳桿菌的L-乳酸酸菜顏色黃嫩，氣味清新，口感清脆優于傳統酸菜；含有對人體有益的L-乳酸，Vc含量高于傳統酸菜，亞硝酸鹽低于傳統酸菜，而傳統酸菜中檢測不到L-乳酸；再者L-乳酸酸菜比傳統酸菜發酵時間減少一半，縮短了生產周期；所以接入副干酪乳桿菌對酸菜的品質和安全性有很大的影響，大大提高了酸菜的品質和安全性。