枯草芽孢桿菌高產角蛋白酶發酵條件優化

冒鑫哲，彭政，周冠宇，堵國成，張娟

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 協同創新中心，江蘇 無錫，214122)4(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

角蛋白是羽毛、羊毛、角、頭發、指甲、蹄的主要成分[1]，其結構中包含大量高度交聯的二酶硫鍵，不易被普通蛋白酶降解[2]。全球禽業每年產生幾百萬噸羽毛廢棄物，畜牧業還以皮革、毛發和馬蹄等形式產生數百萬噸角蛋白廢棄物[3]，這些廢棄物不僅浪費蛋白質資源，也造成空氣、土壤和水的污染。角蛋白酶是一類特殊的蛋白水解酶，具有特異性降解不溶性角蛋白的能力[4],主要由細菌、真菌和放線菌產生[5-6],具有降解不溶性蛋白的特性，可用于羽毛降解。角蛋白酶在飼料[7-8]、肥料[9]、洗滌劑[10]、皮革[11-12]、紡織[13]、化妝品行業[14]和醫療[15]等領域有著廣泛的應用前景。

目前，針對角蛋白酶發酵優化的研究，主要集中在野生菌的篩選、發酵培養基成分和發酵條件的優化[16]，最常見的產角蛋白酶的菌是細菌，具有發酵周期短、酶活性高、生產安全性好等優點，具有良好應用前景[17-20]。廖朝勇等[18]在枯草芽孢桿菌WB600中構建角蛋白酶重組菌WB600-K，通過單因素試驗及正交試驗進行發酵優化，酶活性達到56.9 U/mL，較優化前提高49.74%；蔣彪等[19]通過篩選獲得一株產角蛋白酶菌株，鑒定為芽孢桿菌，利用單因素優化，酶活性達到337.6 U/mL，是優化前的1.26倍。TIWARY等[20]通過單因素和響應面試驗進行培養基優化，產角蛋白酶菌株酶活性達到1 962 U/mL，酶活性提高8倍。

角蛋白酶性能突出，在工業化應用中潛力巨大，但目前能夠實現角蛋白酶高效生產的例子較少[21]。課題組前期研究中，成功構建了1株能夠高效生產角蛋白酶的枯草芽孢桿菌工程菌WB600-p43-ker，角蛋白酶基因來源為地衣芽孢桿菌。本研究對產角蛋白酶菌株WB600-p43-ker發酵培養基成分以及發酵培養條件進行優化，提高發酵水平，降低發酵成本，為工業化生產提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株及質粒

質粒pP43NMK、宿主菌枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB600由本實驗室保藏；枯草芽孢桿菌工程菌WB600-p43-ker為本實驗室構建。

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10。(固體培養基加20 g/L瓊脂)，121 ℃滅菌15 min。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，Na2HPO4·12H2O 6，KH2PO43，MgSO4·7H2O 0.3，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

ZQZY-VAF振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司；恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；5418高速離心機，德國Eppendorf公司；T&J-Atype臺式玻璃生物反應器，迪必爾生物工程有限公司；UVmini-1280紫外分光光度計，島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株培養方法

菌株活化：取保存于-80 ℃的甘油菌1支于LB固體培養基上劃線，37 ℃培養14～16 h。

一級種子液培養：從平板上挑取單菌落接種于3 mL LB培養基中，37 ℃、220 r/min培養過夜。

二級種子液培養：250 mL三角瓶裝50 mL LB培養基，將一級種子液按體積分數2%接種量接入LB培養基中，37 ℃、220 r/min培養4～6 h。

搖瓶發酵培養：250 mL三角瓶裝50 mL發酵培養基，將二級種子液按體積分數5%接種量轉接至發酵培養基中，37 ℃、220 r/min培養24 h，測定發酵液酶活力。

1.3.2 角蛋白酶酶活力測定方法

粗酶液制備：將發酵獲得的菌液于4 ℃、7 000 r/min離心5 min。

酶反應：向1.5 mL離心管中加入150 μL Gly-NaOH溶液(pH 10)、100 μL 25 g/L可溶性角蛋白和50 μL角蛋白酶溶液，混合均勻，于60 ℃中反應20 min；加入200 μL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液終止反應，12 000 r/min離心2 min。對照組為加入酶液前加入200 μL三氯乙酸溶液。

顯色反應：取200 μL上清液加入到1 mL 50 g/L Na2CO3溶液中，加入200 μL福林酚試劑，混合均勻，50 ℃顯色10 min，使用分光光度計測定波長660 nm下的吸光度。

酶活力定義：1 U為吸光度在波長660 nm下升高0.001單位[22]。

1.3.3 單因素試驗

1) 培養基碳源優化：以初始培養基為基礎，分別使用葡萄糖、半乳糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、糊精和淀粉為碳源，添加質量濃度為20 g/L，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力；添加不同質量濃度的蔗糖(10、15、20、25、30、35、40 g/L)，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力。

2) 培養基氮源優化：在現有優化的基礎上，分別使用蛋白胨、酵母浸膏、麩皮、豆粕、玉米漿粉、(NH4)2SO4和NH4Cl為氮源，添加質量濃度為30 g/L，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力；分別添加不同質量濃度豆粕(20、25、30、35、40、45、50 g/L)測定發酵液酶活力。在已經確定1種氮源的基礎上，添加第二氮源(NH4)2SO4、NH4Cl、玉米漿粉、蛋白胨、酵母浸膏，添加質量濃度為10 g/L，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力；分別添加不同質量濃度酵母浸膏(1、5、10、15、20、25、30 g/L)，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力。

3) 培養基金屬離子優化：在現有優化基礎上，在培養基中添加K+、Na+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+，添加質量濃度為0.3 g/L，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力；分別添加不同質量濃度MgSO4·7H2O(0.1、0.3、0.5、1、1.5 g/L)，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力。

5) 培養基初始pH優化：在現有優化基礎上，改變發酵培養基的初始pH(6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10)，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力。

6) 培養基接種量優化：在現有優化基礎上，將種子液以不同接種量(體積分數1%、3%、5%、7%、9%)接入發酵培養基中，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力。

7) 培養溫度優化：在現有優化基礎上，調整培養發酵溫度(30、32、35、37、40 ℃)，搖瓶培養24 h，測定發酵液酶活力。

1.3.4 響應面試驗

1) Plackett-Burman試驗設計：將單因素試驗的8個因素作為試驗的因素，以角蛋白酶酶活力(Y)為響應值，利用Minitab 19軟件進行n=12的Plackett-Burman(PB)試驗設計。PB試驗設計的各因素與水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman設計因素與水平Table 1 Factors and levels of the Plackett-Burman design

2) Box-Behnken中心組合試驗：采用Box-Behnken中心組合試驗進行實驗條件優化，以酵母浸膏(A)、pH(B)、溫度(C)為變量，以角蛋白酶酶活力(Y)為響應值設計3因素3水平試驗，試驗方案中的各因素和水平如表2所示。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.3.5 發酵罐放大實驗

使用優化后的培養基及發酵條件對菌株進行3 L發酵罐試驗。裝液量1.5 L，按體積分數5%接種量轉接二級種子至發酵罐中，初始條件為溫度37 ℃、pH 7.68、通氣量1.5 L/min。控制發酵過程中pH 7、溫度37 ℃、溶氧25%～30%；由于實驗室前期驗證了補料葡萄糖或蔗糖對產酶無顯著影響，故發酵時使用便于檢測的葡萄糖進行補料，按照發酵時間9～16 h以30 mL/h、26～30 h以25 mL/h恒速補料，葡萄糖質量濃度為720 g/L；發酵10 h后以0.5 mL/h速度補料消泡劑。發酵過程中定時取樣測定菌體濃度和角蛋白酶酶活力。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 最佳碳源的確定

選用價格低廉的7種碳源進行培養基碳源優化，結果如圖1所示。當碳源為蔗糖時，酶活力最高，麥芽糖和糊精次之，甘油最低。當培養基中的蔗糖質量濃度30 g/L時，酶活力最高，但進一步提高蔗糖質量濃度酶活力下降。有文獻報道，蔗糖質量濃度過高導致滲透壓增大，影響菌株的生長與產酶[23]。因此，選擇質量濃度30 g/L蔗糖作為發酵培養基的碳源。

a-碳源種類對發酵產角蛋白酶的影響; b-蔗糖添加量對發酵產角蛋白酶的影響圖1 碳源對發酵產角蛋白酶的影響Fig.1 Effects of single cabon source on the production of keratinase

2.1.2 最佳氮源的確定

選用價格低廉的8種氮源進行氮源優化，結果如圖2所示。有機氮源作為唯一氮源的效果明顯優于無機氮源。當使用豆粕作為氮源時，酶活力最高。當培養基中豆粕質量濃度40 g/L時，酶活力最高，繼續提高豆粕質量濃度，酶活力無明顯變化。由于不同來源的氮源對菌體生長和產酶促進作用不同，當使用復合氮源時，對產酶有進一步的促進作用[23,24]，故向發酵培養基中添加第二氮源，探究其對產酶的影響。

a-氮源種類對發酵產角蛋白酶的影響; b-豆粕添加量對發酵產角蛋白酶的影響圖2 氮源對發酵產角蛋白酶的影響Fig.2 Effects of nitrogen source on the production of keratinase

培養基中添加第二氮源結果如圖3所示。添加酵母浸膏促進產酶的效果最好，蛋白胨次之，而(NH4)2SO4、NH4Cl和玉米漿粉對產酶有抑制作用。當培養基中酵母浸膏質量濃度為5 g/L時，酶活力最高。因此，選擇質量濃度40 g/L豆粕和質量濃度5 g/L酵母浸膏作為發酵培養基的氮源。

a-氮源種類對發酵產角蛋白酶的影響;b-酵母浸膏添加量對發酵產角蛋白酶的影響圖3 第二氮源對發酵產角蛋白酶的影響Fig.3 Effects of the second nitrogen source on the production of keratinase

2.1.3 最佳金屬離子的確定

不同金屬離子對產酶的影響如圖4所示。其中，添加Mg2+時，酶活力最高。可能原因是Mg2+促進菌體的生長代謝，進而促進角蛋白酶的合成和分泌[25]。當培養基中MgSO4·7H2O質量濃度為0.3 g/L時，酶活力最高。因此，選擇質量濃度0.3 g/L MgSO4·7H2O作為發酵培養基的最佳金屬離子。

2.1.4 最佳磷酸鹽質量濃度的確定

磷酸鹽對產酶影響如圖5所示。低質量濃度磷酸鹽對產酶抑制較明顯，磷酸鹽質量濃度4.5 g/L后，酶活力最高，繼續提高磷酸鹽質量濃度，酶活力無明顯變化。當磷酸鹽質量濃度達到22.5 g/L時，酶活力下降。為降低發酵成本，確定產酶最佳磷酸鹽質量濃度為4.5 g/L即Na2HPO4·12H2O質量濃度為 3 g/L，KH2PO4質量濃度為1.5 g/L。

a-金屬離子種類對發酵產角蛋白酶的影響; b-MgSO4·7H2O添加量對發酵產角蛋白酶的影響圖4 金屬離子對發酵產角蛋白酶的影響Fig.4 Effects of metal ions on the production of keratinase

圖5 磷酸鹽質量濃度對發酵產角蛋白酶的影響Fig.5 Effects of phosphate concentration on the production of keratinase

2.1.5 最佳初始pH的確定

初始pH對產酶的影響如圖6所示。培養基初始pH在7～8時，酶活力最高；初始pH<7時，對產酶抑制較大；初始pH在8.5～10時，酶活力降低，與酸性環境相比，菌株對堿性環境的耐受性較強。因此，確定初始pH 7.5為發酵產酶最適初始pH。

圖6 pH對發酵產角蛋白酶的影響Fig.6 Effects of pH on the production of keratinase

2.1.6 最佳接種量的確定

接種量對產酶的影響如圖7所示。當接種量為體積分數1%～5%時，酶活力隨著接種量的增加而增加；接種量為體積分數5%時，酶活力最高。因此，確定接種量體積分數5%為發酵產酶最佳接種量。

圖7 接種量對發酵產角蛋白酶的影響Fig.7 Effects of inoculum on the production of keratinase

2.1.7 最佳發酵溫度的確定

溫度對產酶的影響如圖8所示。隨著溫度的升高，發酵酶活力呈現先提升后降低的趨勢。在溫度37 ℃時，酶活力最高。因此，確定37 ℃為發酵產酶最佳溫度。

圖8 溫度對發酵產角蛋白酶的影響Fig.8 Effects of temperature on the production of keratinase

2.2 Plackett-Burman試驗設計

在單因素試驗的基礎上，用Minitab 19軟件設計Plackett-Burman(n=12)試驗。選取單因素試驗中的8個因素進行顯著性考察，試驗結果見表3。由表4方差分析結果可知，X3、X6和X8,即酵母浸膏、pH和溫度在進行F檢驗后，P<0.05，因此以上3因素均為顯著因素，選定并進行下一步優化試驗。

表3 Plackett-Burman試驗結果Table 3 Results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗方差分析Table 4 The variance of the Plackett-Burman experiments

2.3 響應面設計與分析

2.3.1 Box-Behnken試驗設計與結果分析

將酵母浸膏(A)、pH(B)、接種量(C)作為變量，以角蛋白酶酶活力(Y)為響應值，進行響應面試驗設計，試驗結果見表5。利用Design-Expert 8.0軟件試驗結果進行分析，得到回歸方程為：

表5 Box-Behenken試驗結果Table 5 Results of Box-Behenken design experiments

Y=256 300+7 865A+14 760B+17 965C-8 070AB-8 720AC+5 350BC-8 231A2-20 261B2-36 291C2。

表6 Box-Behenken試驗方差分析Table 6 The variance of Box-Behenken design experiments

2.3.2 模型預測與驗證實驗

利用Design-Expert 8.0軟件，分析3種顯著性因素酵母浸膏、pH、溫度的響應面和等高線。預測得到發酵培養基最佳工藝參數為酵母浸膏質量濃度5.72 g/L，pH 7.68，溫度37.69 ℃，理論最高酶活力可達到261 711 U/mL。為驗證模型的準確性及重復性，利用上述最佳工藝參數進行3次平行驗證，測定角蛋白酶的平均酶活力為(260 480±1 430) U/mL，實際值與理論值較為接近，說明采用響應面法優化能夠很好地預測枯草芽孢桿菌產角蛋白酶的實際情況。

2.4 發酵罐放大產角蛋白酶試驗

為使優化后的結果能夠更好地指導工業生產，對該結果進行3 L發酵罐發酵放大試驗，發酵曲線如圖9所示。由圖9可知，角蛋白酶酶活力和菌體生長曲線基本一致。當菌株發酵培養進入對數中期后，發酵酶活力迅速提高，角蛋白酶被大量表達。當發酵時間達到26 h時，酶活力達到最大值，為704 400 U/mL，發酵罐發酵水平高于搖瓶發酵水平，可能是發酵罐培養比揺瓶培養具有更穩定的pH及溶氧條件。酶活力峰值過后菌體濃度和酶活力同時開始下降，推測由于菌株生長進入衰亡期，菌體自溶導致酶活力下降。

圖9 菌株發酵產角蛋白酶曲線Fig.9 Fermentation curve on the production of keratinase

3 結論

本研究在單因素試驗的基礎上，利用Plackett-Burman設計篩選出酵母浸膏、pH、溫度3個顯著因素，利用Box-Behnken中心組合設計確定最優的角蛋白酶菌株發酵條件。確定了優化的發酵培養基為30 g/L蔗糖、40 g/L豆粕、5.72 g/L 酵母浸膏、3 g/L Na2HPO4，1.5 g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4；優化的培養條件為培養溫度37.69 ℃，接種量體積分數5%，pH 7.68。在此優化條件下，菌株搖瓶發酵酶活力為260 480 U/mL，較優化前酶活力提高4.26倍，3 L發酵罐發酵26 h酶活力達到最大值704 400 U/mL，超過文獻報道的最高水平，優化后發酵原料成本較優化前降低了96%。本研究顯著提高了產酶水平并降低了生產成本，為工業上生產角蛋白酶提供參考。