超聲波輔助兔骨粉脫脂工藝優化

許晶冰，李雪，賀稚非，毛慶

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶，401121)3(重慶市農業科學院 農產品貯藏加工研究所，重慶，401329) 4(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

骨頭約占動物體重的20%～30%，是一種營養價值非常高的肉類加工副產物，含有大量的礦物質、蛋白質、脂質等營養成分[1]。科學界對骨的研究利用逐漸深入，對骨進行100%加工利用，制備骨粉、骨泥、骨蛋白、軟骨素、骨油、骨碳等，既可變廢為寶，又能減少環境的污染[2-9]。兔肉由于“四高”、“四低”的營養特性，被視為功能性肉制品而風靡全球[10]。兔肉產量的增加，兔骨等兔肉加工副產品也隨之增多，大多數企業直接將兔骨拋棄或當作飼料，兔骨的附加值低且對環境造成負擔。目前，兔骨的加工利用研究尚處于起步階段，如何對兔骨進行高效加工和在其余食品原料中的應用等仍需進一步研究。

項目組[11-15]前期利用干法球磨技術，制備得到平均粒徑為0.5～21.9 μm的微細兔骨粉，并研究了其部分營養及理化性質，這為兔骨粉作為優質鈣源奠定了基礎，但制備的骨粉脂肪含量較高(8%～13%)，這會使骨粉產生腥味等不良風味，且不利于骨粉的長期保存，若將兔骨粉更好地應用于其他食品中，仍需要進一步脫脂。因此，本研究選取適當部位兔骨為原料，采用項目組前期研究的高溫高壓蒸煮預處理制備兔骨粉，然后利用Box-Behnken響應面試驗優化超聲波輔助法對兔骨脫脂，制備得到無異味的脫脂兔骨粉(de-fat rabbit bone meal, DF-RBM)，這將為骨粉在食品中的應用提供適宜的原料，為工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用兔購于重慶市渝北區阿興記原種兔養殖基地，品種為伊拉配套系商品代，日齡70～75 d(體重2.5 kg左右)，按常規方法宰殺、去皮、去頭、去內臟后，取兔的四肢，用手術刀及手術剪小心剔除四肢骨表面肌肉、脂肪、骨連接處結締組織等，保留骨的部分，真空密封包裝后于-21 ℃凍藏備用。

正己烷、乙酸乙酯為優級純，濃硫酸為分析純，成都科龍化工試劑廠；石油醚(30～60 ℃，分析純)，天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DZ-400真空包裝機，沈陽東泰機械制造有限公司；LDZM-80KCS 壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；FW100 高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；BJ-800A 粉碎機，杭州拜杰科技有限公司；KQ-600DB 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HWS-26 恒溫水浴鍋，上海齊欣科學儀器有限公司；Basis Hei-VAP Value 旋轉蒸發器，德國海道夫公司；DHG-9053 J 恒溫鼓風干燥箱，上海三發科學儀器有限公司；B-81 脂肪抽提測定儀，瑞士步琪公司；KJELTEC 8400 全自動凱氏定氮儀，丹麥福斯公司；Milli-q reference 超純水系統，美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 兔骨粉的制備

根據李少博等[12,14]納米級兔骨粉的制備工藝并作少量修改，對兔骨進行高溫蒸煮軟化處理，工藝流程如下：

凍骨4 ℃解凍→清水漂洗3次→高溫高壓蒸煮[液料比1.5∶1(g∶g)，0.12 MPa、120 ℃，蒸煮2 h]→冷卻至100 ℃→傾倒蒸煮液取出骨→清水漂洗3次→瀝干→折斷成2～3 cm碎骨→50 ℃烘干過夜→粉碎機初步粉碎。

清水漂洗的目的是去除骨表面多余脂肪、血水及水溶性蛋白質等。干燥后的碎骨，用BJ-800A粉碎機(粉碎6 s、停頓6 s)粉碎數次，粉碎至過60目篩(250 μm)后，得到兔骨粉(rabbit bone meal, RBM)。

1.3.2 脫脂劑的選擇

設計60 ℃熱水組、乙酸乙酯組、正己烷組3組實驗，篩選出適宜兔骨粉的脂肪提取劑。取5 g RBM至50 mL離心管中，按照液料比3∶1(g∶g)分別加入3種脫脂劑，恒溫(熱水組設定溫度60 ℃，其余組室溫30 ℃)150 r/min搖床混搖2 h，再將骨粉置于提前預熱好的超聲機中，固定超聲波處理溫度(熱水組設定溫度60 ℃，其余組30 ℃，超聲波過程用冰袋控制溫度)、超聲波功率300 W、超聲波處理時間30 min，超聲結束后在4 000 r/min下離心10 min，離心結束后立即傾倒上清液，取剩余骨渣于60 ℃干燥至恒重，分別制備得到RBM1、RBM2、RBM3。

按國標法[16-18]測定RBM及RBM1、RBM2、RBM3的蛋白質含量、水分含量、脂肪含量，按公式(1)和(2)計算脫脂率及蛋白質保留率，比較不同溶劑的脫脂效果：

(1)

(2)

式中：R，脫脂率，%；W，蛋白質保留率，%；w0，RBM脂肪含量(干基)，%；w1，脫脂后骨粉脂肪含量(干基)，%；w0蛋白質，RBM蛋白質含量(干基)，%；w1蛋白質，脫脂后骨粉蛋白質含量(干基)，%。

1.3.3 單因素試驗

在室溫(30 ℃)條件下，對RBM進行超聲波輔助脫脂工藝優化單因素試驗，各因素基本條件：超聲波功率300 W、超聲波處理時間30 min、液料比3∶1(g∶g)。

脫脂工藝：取5 g RBM至50 mL離心管中，按液料比加入脫脂劑，斡旋振動1 min，然后置于提前預熱好的超聲波清洗機(30 ℃)中處理，超聲波處理過程用冰袋控制溫度；之后于4 000 r/min下離心10 min，離心結束后立即傾倒上清液，溶劑用旋轉蒸發儀回收(蒸發溫度44 ℃)，取剩余骨渣于60 ℃下干燥至恒重。各單因素試驗參數如下：

單因素1(液料比)試驗：液料比2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1(g∶g)；

單因素2(超聲波功率)試驗：超聲波功率240、300、360、420、480 W；

單因素3(超聲波處理時間)試驗：超聲波處理時間0、5、10、15、20、25、30、40 min。

以上共計18組樣品，測定所有樣品脂肪及水分含量，按公式(1)計算脫脂率(%)。

1.3.4 超聲波處理輔助脫脂工藝響應面試驗

根據單因素試驗結果，篩選出液料比5∶1(g∶g)、超聲波功率360 W、超聲波處理時間15 min為最優，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以脫脂率(%)為響應值，設計3因素3水平的響應面試驗，試驗設計如表1所示。

表1 響應面試驗各因素水平設計表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.3.5 超聲波輔助法脫脂工藝驗證

響應面試驗結束后，根據模型預測液料比5.33∶1(g∶g)，超聲波功率460 W，超聲波處理時間24.44 min為脫脂最優工藝參數，此時脫脂率預測達到97.31%。因此，根據生產實際，進行驗證實驗。

取5 g RBM至50 mL離心管中，按液料比5.3∶1(g∶g)加入脫脂劑乙酸乙酯，斡旋振動1 min，然后將樣品置于提前預熱好的超聲波清洗機(30 ℃)中，超聲波功率480 W，超聲波處理時間24 min，超聲波過程中用冰袋控制溫度。之后于4 000 r/min下離心10 min，離心結束后立即傾倒上清液，溶劑回收，取剩余骨渣于60 ℃下干燥至恒重，測定樣品脂肪及水分含量，按公式(1)計算脫脂率(%)。根據實驗結果，計算驗證值與預測值的相對誤差，判斷模型有效性。最后確定超聲波輔助法兔骨脫脂工藝的最優參數。

1.3.6 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 19.0進行數據統計及差異性分析。

2 結果與分析

2.1 脫脂劑的選擇

參考劉文媛等[19]及秦曉潔等[20]在制備脫脂牛骨中的研究，選擇了幾種提取效果好、安全性高的試劑進行脫脂實驗，結合生產實際，選取60 ℃熱水、乙酸乙酯、正己烷對兔骨粗粉進行脫脂，分別制備得到RBM1、RBM2、RBM3。各提取劑的脫脂效果如圖1所示,與熱水相比，乙酸乙酯和正己烷的脫脂效果較好。在脫脂率方面，熱水的脫脂率僅19.57%，顯著低于乙酸乙酯(68.08%)、正己烷(64.65%)(P<0.05)；而在保留蛋白質方面，熱水提取脂肪后兔骨粉蛋白質流失較大，這可能與骨中的水溶性蛋白流失及加熱條件下膠原蛋白等降解有關[21]，蛋白質保留率為63.91%，顯著低于其余2組(P<0.05)，其中，乙酸乙酯對骨粉中的蛋白質保留率高達99.74%，對骨粉中的蛋白質含量基本沒影響，而正己烷組的蛋白質保留率為89.80%，這可能是由于部分蛋白極性較小與正己烷相容后流失。綜上，基于較高的脫脂率、蛋白質保留率，篩選出乙酸乙酯作為兔骨粉的脫脂劑。

圖1 不同提取劑制備的兔骨粉脫脂效果Fig.1 Degreasing effect of rabbit bone meal prepared with different extraction reagents注：同一指標下不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 單因素試驗

在室溫條件下，以乙酸乙酯為脫脂劑，采用超聲波輔助工藝對RBM進行脫脂，用單因素試驗探究液料比、超聲波功率及超聲波處理時間對脫脂率的影響，試驗結果如圖2所示。由圖2-a可知，液料比2∶1～5∶1(g∶g)時，隨著液料比的增加，RBM的脫脂率顯著增加(P<0.05)，當液料比達到5∶1(g∶g)時，脫脂率高達88.86%，液料比繼續提高至6∶1(g∶g)時，脫脂率不再顯著升高(P>0.05)，這與秦曉潔等[20]在牦牛骨脫脂中的研究結果一致，當脫脂溶劑用量增大到一定程度后，動物骨中油脂已大部分溶出，再增加溶劑用量也無法提高濃度差導致的傳質推動力[22]；由圖2-b可知，隨著超聲波功率的增大，超聲波的空化效應和機械振動增強，促進了分子擴散[23]，因而RBM脫脂率提高，當超聲波功率提高至360 W時，脫脂率高達89.38%，而超聲波功率繼續提高后，脫脂率卻顯著降低(P<0.05)，這與劉文媛等[19]的研究結果一致，可能是過高的超聲波動使溶液中產生自由基及局部的瞬時高溫對油脂產生破壞作用所致，因而超聲波功率不宜過大；而超聲波處理時間對RBM脫脂率的影響類似，如圖2-c所示，當超聲波處理時間超過25 min后，脫脂率顯著降低(P<0.05)，且在提取過程中發現長時間的超聲波提取，會導致溶劑呈白色懸濁液，這可能是由于長時間的超聲波動導致了溶液的乳化，從而降低了提取效率，因而超聲波處理時間不宜過長，且從生產成本考慮，超聲波處理15 min即可達到較好的脫脂率(79.73%)，這與超聲波處理20～25 min差異不大。綜上，選取液料比5∶1(g∶g)，超聲波功率360 W，超聲波處理時間15 min，作為后續優化實驗的最適條件。

圖2 各因素對RBM脫脂率的影響Fig.2 The influence of various factors on the degreasing rate of RBM

2.3 響應面試驗

響應面試驗共17個試驗點，其中5個零點試驗以評估誤差，12個為析因點，試驗結果如表2所示。將表2中的數據運用Design-Expert 10.0軟件進行統計分析，得到脫脂率(R)與液料比(A)、超聲波功率(B)、超聲波時間(C)之間的二次回歸方程：

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

R=88.16+1.30A+2.64B+0.92C+0.56AB+0.53AC+0.03BC-0.24A2-0.04B2+0.56C2，R2=0.927 3

對回歸方程的ANOVA方差分析結果如表3所示，模型的F值為9.91，P<0.01，說明脫脂率R與液料比(A)、超聲波功率(B)、超聲波處理時間(C)回歸方程的關系極顯著，方程可用；失擬項平方和較小(1.22)，P>0.05，表示不具顯著性差異，說明方程與實際擬合度高，其他因素對試驗結果的干擾較小；信噪比較高，為10.85(>4)，表明該模型可用于預測，方程的可信度高；變異系數小，僅為1.07%(<15%)，表明試驗重現性好，模型可靠[24-25]。綜上所述，以脫脂率為響應值所建立的兔骨粉超聲波輔助脫脂優化工藝的模型是合理的，該模型可對兔骨粉超聲波輔助脫脂工藝參數進行優化并對脫脂率進行預測。由表3中各項系數的顯著性檢驗可知，該模型的一次項A和B極顯著(P<0.01)，對模型貢獻大，C的P值<0.05，對脫脂率影響顯著；交互作用項AB、AC、BC及平方項A2、B2、C2均不顯著(P>0.05)。

表3 脫脂率回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model on degreasing rate

響應面3D圖可以較為直觀地顯示出響應值隨因素的變化情況，曲面越陡峭表明該因素對響應值的影響越大，而投影下的等高線圖越近似橢圓形，表示這2個因素對響應值的交互作用就越強[12]。根據F值及響應面3D圖可以判斷，液料比、超聲波功率及超聲波處理時間對兔骨的脫脂率都有一定的影響，且影響程度為超聲波功率B>液料比A>超聲波時間C，而2因素之間的交互性不顯著，這與秦曉潔等[20]的研究結果一致。

2.4 驗證實驗

經過 Design-Expert 10.0軟件統計分析，設置在脫脂率大于85%的情況下，預測出超聲波輔助脫脂的最優工藝為液料比5.33∶1(g∶g)，超聲波功率460 W，超聲波處理時間24.44 min，脫脂率預測值為97.31%。結合生產實際的可操作性，將上述工藝進行微小改動，調整為液料比5.3∶1(g∶g)，超聲波功率480 W，超聲波處理時間24 min。在此條件下進行5次重復試驗，得到兔骨粉RBM的脫脂率為(94.63±0.20)%，這與理論預測值的相對誤差為2.75%(<5%)，故模型有效。因此，經單因素試驗、響應面法優化得到的兔骨粉超聲波輔助法脫脂工藝參數準確可靠，這將為生產提供一定的理論依據。

圖3 各因素交互作用對RBM脫脂率影響的3D圖Fig.3 3D diagram of the interaction of various factors on the degreasing rate of RBM

3 結論

本試驗在室溫(30 ℃)條件下，利用超聲波輔助溶劑對兔骨粉進行脫脂工藝優化，篩選出乙酸乙酯為兔骨粉脫脂劑，該脫脂劑脫脂效果好，且對骨粉中的蛋白質保留率高；經單因素試驗，超聲輔助脫脂的最佳工藝條件為液料比5∶1(g∶g)、超聲波功率360 W、超聲波處理時間15 min；根據單因素及Box-Behnken響應面試驗，建立了兔骨粉脫脂工藝的數學模型，得到兔骨超聲波輔助脫脂工藝最優參數為液料比5.3∶1(g∶g)，超聲波功率480 W，超聲波處理時間24 min，此條件下制備得到無異味的DF-RBM，脫脂率達到(94.63±0.20)%，與理論預測值的相對誤差<5%，故模型能較好地預測脫脂工藝參數對兔骨粉的脫脂效果，這將對改善兔骨等動物骨粉的加工提供參考。