碳酸二甲酯三相分配體系萃取分離螺旋藻多糖

羅光宏，雷婕，張喜峰1,*，敬麗娜，王鑫鑫，楊生輝，張青婷

1(河西學院 甘肅省微藻技術創新中心，甘肅 張掖，734000)2(甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖，734000)3(河西學院 生命科學與工程學院，甘肅 張掖，734000)

螺旋藻(Spirulinaplatensis)又稱鈍頂節旋藻(Arthrospiraplatensis)，是一種藍綠藻，其含有蛋白質、碳水化合物、必需脂肪酸、維生素、礦物質和色素，如類胡蘿卜素、葉綠素和藻藍蛋白等[1-2]。多糖作為最重要活性成分之一，受到國內外研究學者極大關注，其具有增強免疫、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇等多種生物活性和功能，在食品、醫藥、化妝品等領域具有廣闊的應用前景[3-6]。天然多糖通常采用浸漬、熱回流提取，經脫蛋白、脫色、透析等一系列分離程序，再經柱層析得到高純度的多糖。然而，上述操作和工藝存在耗時長、能耗高、成本昂貴，使用有毒溶劑，對人體健康和環境有害。因此，不利于在食品、醫藥、化妝品等領域的廣泛應用。

目前，三相分配體系(three-phase partitioning,TPP)作為一種簡便、快速和綠色的萃取方法已廣泛應用于天然產物中多糖、蛋白質、酶、酶抑制劑、油脂和小分子等提取和分離[7-8]。此外，該技術在室溫下易于大規模進行，因此適用于對溫度敏感的生物活性分子提取和分離[9]。在典型的TPP體系中，硫酸銨作為無機鹽相，叔丁醇作為有機相，通常用于從粗提物或懸浮液中分離生物活性分子[8,10-11]。叔丁醇由于其高沸點、低可燃性以及顯著地促進水分子締合和擁擠效應[10]而被廣泛應用于TPP。盡管叔丁醇對皮膚和眼睛有一定的毒性和刺激性，但仍被廣泛應用于各種TPP體系[12]。與叔丁醇相比，碳酸二甲酯具有較低的皮膚刺激性和毒性[13-14]，被認為是一種較為綠色的溶劑[15-16]。PANADARE等[17]使用碳酸二甲酯作為叔丁醇的替代溶劑，建立了一種以碳酸二甲酯為有機相、檸檬酸鈉為鹽相的新型TPP體系，用于苦瓜過氧化物酶的提取和純化。近年來，本課題組利用叔丁醇、硫酸銨三相體系從螺旋藻多糖粗提液中萃取分離螺旋藻多糖(polysaccharides ofSpirulinaplatensis,PSP)[18]。然而，目前尚未有研究報道基于碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的新型TPP萃取分離PSP。

因此，本研究以碳酸二甲酯為有機相，檸檬酸鈉為鹽相，采用新型TPP萃取分離PSP，通過單因素試驗和響應面法優化，研究了碳酸二甲酯與粗提液體積比、檸檬酸鈉質量濃度、溫度和pH值等提取工藝參數對PSP和蛋白質含量的影響，并與叔丁醇和硫酸銨形成TPP制備的PSP理化性質和體外抗氧化活性進行了比較研究。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與儀器

螺旋藻，甘肅省微藻技術創新中心。

課題組前期研究[18]所用叔丁醇和硫酸銨的TPP體系制備的PSP,在本研究中命名為PSP-T。

碳酸二甲酯、檸檬酸鈉、苯酚、濃硫酸、葡萄糖均為分析純。透析袋(分子截留量8～12 kD)，單糖標準品(D-來蘇糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-鼠李糖和D-木糖)、三氟乙酸,成都德思特生物技術有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸((R)-(+)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox)、H2O2、2，2-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2，2′-azino-bisc3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)，上海源葉生物科技有限公司。

PL-203電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Alpha-1860Plus紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；GC-MS6800氣相色譜質譜聯用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司；GPC-IR高溫凝膠滲透色譜儀，北京億路達機電設備有限公司；Nicolet iS50紅外光譜儀，美國Thermo Scientific。

1.2 實驗方法

1.2.1 螺旋藻多糖粗提液的制備

參照前期研究方法制備螺旋藻多糖粗提液[18]。

1.2.2 基于碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP萃取PSP

采用碳酸二甲酯為有機相，檸檬酸鈉為鹽相，參考PANADARE等[17]，略作改動。將給定量的檸檬酸鈉(0.1～0.5 g/mL)加入10 mL多糖粗提液中，攪拌溶解后，加入2.5～20 mL碳酸二甲酯。隨后，將混合物置于20～40 ℃的振蕩培養箱中30 min，4000 r/min離心10 min，形成透明相。收集下相，在蒸餾水中透析48 h(MWCO:8 k～12kDa)，凍干得到部分純化的PSP-D，考察碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比、檸檬酸鈉質量濃度(g/mL)、溫度、pH值對PSP-D萃取效果的影響。通過添加1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH水溶液，調整體系pH值。PSP-D的萃取得率采用公式(1)計算:

(1)

式中：m,為螺旋藻粉末質量;ρ和V分別為PSP在下相中的質量濃度和體積。

1.2.3 響應面優化三相萃取條件

采用響應面中Box-Behnken設計(Box-Behnken design,BBD)，優化碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比(A)、檸檬酸鈉質量濃度(B，g/mL)、溫度(C，℃)和pH(D)操作參數對TPP工藝的影響。以4個因素為自變量，以PSP-D的萃取得率(Y，%)為響應值。

表1為整個實驗設計及自變量和測定響應值。對BBD實驗得到的數據進行回歸分析，通過以下二階多項式模型發現響應函數與變量的相關性。

(2)

式中：Y,響應值(PSP-D萃取得率，%);A0、Ai、Aii和Aij分別為截距項、線性項、二次項和交互項的變量系數(i≠j)。采用Design Expert V8.0.6.1 軟件對RSM優化實驗的設計和數據進行分析。

1.2.4 理化性質分析

以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[19]。

三氟乙酸分別水解PSP-D和PSP-T，衍生化后，用氣相色譜法測定其單糖組成。單糖標準品也按照上述步驟進行測定。

采用高效尺寸排阻色譜法(high performance size-exclusion chromatography,HPSEC)結合多角度激光散射(Multi-angle laser light scattering, MALLS，DAWN HELLOS II λ=658 nm)測定平均分子量(Mw)，PSP-D和PSP-T的分子質量(Mn)和分子質量分布(Mw/Mn)。

采用傅里葉變換-紅外光譜(Fourier transform infrared spectrossopy,FTIR)對干燥后PSP-D和PSP-T與光譜純KBr顆粒研磨壓片后，在500～4 000 cm-1的波數范圍內測定。

1.2.5 多糖體外抗氧化活性測定

配制不同質量濃度(0～2.0 mg/mL)的PSP-D和PSP-T多糖溶液，并以Vc作為陽性對照，在室溫下用UV-1601分光光度計測定吸光度。根據羥自由基(·OH)清除活性、DPPH自由基清除活性、Trolox當量抗氧化能力和鐵離子還原/抗氧化能力測定，比較二者的體外抗氧化活性[20]。

1.2.6 數據分析

2 結果和分析

2.1 基于碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP體系制備PSP-D

以碳酸二甲酯為有機相，檸檬酸鈉為鹽相的TPP從螺旋藻多糖粗提液中提取PSP-D。研究了碳酸二甲酯與螺旋藻多糖粗提液體積比、檸檬酸鈉質量濃度、pH值和溫度對PSP-D的萃取得率的影響。

2.1.1 碳酸二甲酯和多糖粗提液體積比對PSP-D萃取效果的影響

固定檸檬酸鈉質量濃度為0.2 g/mL、pH值6.0和溫度25 ℃，圖1-a顯示了碳酸二甲酯和多糖粗提液體積比(0.25∶1.0、0.5∶1.0、1.0∶1.0、1.5∶1.0和2.0∶1.0)對PSP-D萃取得率的影響。隨著碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比例的增加，PSP-D的萃取得率值呈現先增大后逐漸減小的趨勢，當碳酸二甲酯與多糖粗提液比例為0.5∶1.0時，PSP-D的萃取得率達到最高為61.30%。結果表明，碳酸二甲酯作為一種抗溶劑和促進水分子締合劑在TPP中起著重要作用。碳酸二甲酯與檸檬酸鈉在水溶液中協同作用，通過改變水的結構，可以形成較強的分子間鍵合。這不僅有助于增加水溶性多糖在溶液中溶解度，而且有助于大分子蛋白質從下相中沉淀出來[17]。因此，隨著碳酸二甲酯用量的增加，富集在下相中的水溶性PSP-D增加，導致PSP-D的萃取得率增加；但碳酸二甲酯體積的增加會降低PSP-D的萃取得率，可能是由于碳酸二甲酯的促進水分子締合和擁擠效應所致。同時，隨著碳酸二甲酯和多糖粗提液體積比的增加，下相中蛋白質的含量逐漸下降。推測碳酸二甲酯體積的增加可以通過與沉淀蛋白的結合來增加沉淀蛋白的浮力，從而導致更多蛋白質聚集在中間相，使下相中蛋白質含量呈下降趨勢，因此，確定碳酸二甲酯和多糖提取液體積比為0.5∶1.0，作為后續的萃取分離實驗條件。

2.1.2 檸檬酸鈉質量濃度對PSP-D萃取效果的影響

當碳酸二甲酯與多糖粗提液比0.5∶1.0、pH 6.0和溫度25 ℃保持恒定時，研究檸檬酸鈉質量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g/mL)對下相中PSP-D的萃取得率和蛋白質含量的影響，結果如圖1-b所示。隨著檸檬酸鈉質量濃度逐漸增加，PSP-D的萃取得率呈現先增加后減小的趨勢。檸檬酸鈉在TPP中具有鹽溶效應，這可能有利于PSP-D在下相中的有效分配。然而，隨著檸檬酸鈉質量濃度的不斷增加，檸檬酸鈉的鹽析效應在TPP過程中起著重要作用。該效應削弱了PSP-D與水分子在下相中形成的氫鍵網絡，甚至破壞了氫鍵網絡，從而降低了PSP-D的萃取得率。同時，當檸檬酸鈉質量濃度從0.1 g/mL增加到0.5 g/mL時，可溶性蛋白質含量呈下降趨勢。在高質量濃度下，檸檬酸鈉促進了蛋白質的穩定性，更多的游離蛋白質富集在中間相，導致下相中可溶性蛋白質含量降低。因此，檸檬酸鈉質量濃度0.2 g/mL被視為后續TPP試驗的最佳鹽濃度。

a-碳酸二甲酯和多糖粗提液體積比的影響; b-檸檬酸鈉質量濃度的影響; c-溫度的影響； d-pH的影響圖1 不同參數對PSP-D萃取效果的影響Fig.1 Effects of different parameters on extraction yield of PSP-D in the lower aqueous phase

2.1.3 溫度對PSP-D萃取效果的影響

較高的溫度可以加速TPP過程中的傳質速度。本文研究了溫度在20～40 ℃對PSP-D的萃取得率和蛋白質含量的影響。如圖1-c所示，PSP-D的萃取得率隨溫度從20 ℃升高到40 ℃呈現先顯著升高后略有降低的趨勢；如COIMBA等[21]所述，TPP體系中溫度的升高有助于多糖的分子結構暴露出更多親水羥基，這些羥基有助于形成強氫鍵或與水分子的連接，進一步使下相富集更多的PSP-D。TAN等[22]研究結果表明，30 ℃的溫度有利于TPP同時純化蘆薈多糖和蛋白質，提高了蘆薈多糖的提取率。然而，在較高溫度下，少量碳酸二甲酯可降低與檸檬酸鈉的協同效應，從而使PSP-D的萃取得率降低。除了較低的促進水分子締合和擁擠效應外，碳酸二甲酯在較高溫度下的作用可以降低PSP-D的萃取得率。同時，隨著溫度的升高，下相中蛋白質含量從2.21%下降至1.87%。因此，在本研究中，將溫度設置為30 ℃進行后續實驗。

2.1.4 pH對PSP-D萃取效果的影響

pH值作為一個重要因素可以影響大分子的電離基團并改變其表面電荷。碳酸二甲酯與多糖粗提液比為0.5∶1.0、檸檬酸鈉質量濃度為0.2 g/mL、溫度為30 ℃，研究pH值對PSP-D萃取效果的影響。如圖1-d所示，在pH 6.0時，PSP-D的萃取得率最大，蛋白質含量為1.76%。隨著pH值從6.0增加到8.0，PSP-D的萃取得率略有下降，蛋白質含量略有增加；如前期研究所述，叔丁醇和硫酸銨組成的TPP體系的最佳pH值為7.0，這與現有的碳酸二甲酯和檸檬酸鈉組成的TPP體系相似[20]。因此，pH 6.0被認為是PSP-D分配的最佳pH值。

2.2 響應面優化設計

2.2.1 優化TPP工藝參數

采用響應面優化設計的4因子BBD優化TPP工藝參數，以獲得PSP-D最大萃取得率。表1給出了工藝變量和實驗數據。PSP-D的萃取得率值在8.53%～12.05%，當碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比為0.5∶1.0、檸檬酸鈉質量濃度為0.2 g/mL，溫度為30 ℃，體系pH為6.0時，最大萃取得率為12.05%。對實驗數據進行多元回歸分析，得到以下二階多項式方程：

表1 三相分配法萃取分離螺旋藻多糖Box-Behnken實驗設計和結果Table 1 Box-Behnken experimental design and the results for extraction yield of PSP-D from Spirulina platensis by using TPP

Y=11.752-0.091A-0.383B-0.120C+0.365D-0.063AB+0.653AC-0.323AD+0.258BC-0.013BD-0.006CD-1.430A2-0.938B2-0.812C2-1.120D2

(3)

表2 PSP-D萃取得率的二次多項式模型的回歸系數及其顯著性分析Table 2 Regression coefficient estimation and their significant analysis for the quadratic polynomial model of PSP-D yield

2.2.2 響應面分析

響應面3D和2D等高線圖可反映響應值與過程變量水平之間的關系以及2個變量之間的相互作用。結果如圖2所示，PSP-D的萃取得率隨2個變量的增大先增大后減小，在碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比為0.6∶1.00、溫度29.59 ℃時，PSP-D的萃取得率達到最大值，并且橢圓等高線圖進一步表明碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比(A)和溫度(C)顯著，與表2的結果一致。

2.2.3 優化條件驗證

根據方差分析和響應面圖對萃取條件進行優化和驗證，結果表明，基于現有TPP體系的PSP-D的優化條件為：碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比為0.6∶1.00、檸檬酸鈉質量濃度為0.177 9 g/mL和溫度29.59 ℃和pH 6.18。在此條件下，所建模型預測的PSP-D的最大萃取得率為11.84%。考慮到實際生產的可操作性，對最佳工藝條件進行了修正：碳酸二甲酯與多糖粗提液的體積比為0.6∶1.0，檸檬酸鈉質量濃度為0.18 g/mL，溫度為30 ℃，pH 6.0。為了驗證RSM模型的可靠性，在改進的優化條件下進行了3次重復驗證實驗。結果表明，PSP-D的萃取得率為(11.90±0.12)%(n=3)，接近預測值(11.84%)。因此，基于響應面的BBD被認為是一種優化TPP工藝條件的方法。

a-響應面圖; b-等高線圖圖2 碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比和溫度相互作用響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plots and contour plots showing the effects of dimethyl carbonate to crude extract ratio and temperature on the extraction yield of PSP-D

2.3 PSP-D特性

表3總結了采用2種不同的TPP體系從螺旋藻多糖粗提液中制備的PSP-D和PSP-T的含量、單糖組成和分子量大小。優化實驗條件獲得的PSP-D和PSP-T的萃取得率分別為11.90%和9.25%，說明用碳酸二甲酯和檸檬酸鈉形成的TPP體系優于叔丁醇和硫酸銨形成的TPP體系。PSP-D的多糖含量為87.49%，略高于PSP-T的86.17%。PSP-D蛋白質含量低于PSP-T，說明以碳酸二甲酯為有機溶劑的TPP比以叔丁醇為溶劑的TPP更有助于分離富集多糖和蛋白質，這進一步證實了碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP體系分離富集多糖的優越性。

如表3所示，PSP-D和PSP-T為雜多糖，由不同摩爾比的鼠李糖、甘露糖、葡萄糖組成。葡萄糖是PSP-D和PSP-T分子結構中的主要單糖。結果表明，采用2種不同的TPP體系從螺旋藻多糖粗提液中提取的PSP-D和PSP-T具有不同的化學成分。根據HPSEC-MALLS分析，從含叔丁醇和硫酸銨的TPP體系中得到的PSP-T重均分子量Mw為3.597×104，數均分子量為Mn=2.189×104，Mw/Mn=1.643。從含碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP系統中得到的PSP-D重均分子量Mw為5.164×104，Mw/Mn=1.847。PSP-T的Mw和Mw/Mn值均低于PSP-D，說明在碳酸二甲酯和檸檬酸鈉的TPP體系中，PSP-D的解聚較少。

表3 不同三相體系萃取螺旋藻多糖的含量、單糖組成和分子量Table 3 Chemical compositions and physiochemical properties of PSP-D and PSP-T from Spirulina platensis by various TPP systems

圖3為PSP-D和PSP-T紅外光譜，二者具有相似的特征吸收峰，說明二者化學結構類似，在3 385(或3 394)cm-1處寬而強的峰和2 925(或2 929)cm-1處弱的峰分別歸因于O—H和C—H伸縮振動峰；1 652(或1 635)cm-1和1 385(或1 391)cm-1在1 000～1 200 cm-1范圍內的強吸收帶是由于PSP-D和PSP-T中C—O—C和C—O—H基團的拉伸振動引起的，此外，在約861(或858)cm-1處觀察到特征峰，這表明吡喃糖存在于α構型中。

圖3 PSP-D和PSP-T紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of PSP-D and PSP-T

2.4 體外抗氧化活性

圖4顯示了PSP-D和PSP-T對DPPH自由基和·OH的清除能力及Trolox當量抗氧化能力和鐵離子還原/抗氧化能力。如圖4-a和圖4-b所示，PSP-D和PSP-T對DPPH自由基和·OH的清除能力隨質量濃度從0 mg/mL增加到2.0 mg/mL呈劑量依賴性增加，在質量濃度為2.0 mg/mL時，對DPPH和·OH的清除能力分別為85.42%和86.59%，略高于PSP-T(分別為82.19%和84.16%)，但均低于VC(分別為98.89%和98.45%)。PSP-D和PSP-T清除DPPH自由基的IC50分別為0.80和0.86 mg/mL，PSP-D和PSP-T清除·OH能力的IC50分別為0.72和0.78 mg/mL。結果表明，在試驗濃度范圍內，PSP-D具有更強的清除自由基能力。

如圖4-c所示，PSP-D的Trolox當量抗氧化能力和鐵離子還原/抗氧化能力分別為384.62 μmol Trolox/g和29.45 μmol Fe2+/g，略大于PSP-T(分別為372.59 μmol Trolox/g和23.56 μmol Fe2+/g)。結果表明，PSP-D具有比PSP-T更強的抗氧化能力，這與DPPH自由基和·OH清除能力的結果一致。這可能是由于PSP-D比PSP-T具有更高的多糖含量，從而有助于提高體外抗氧化活性。另外，單糖組成、化學結構和鏈構象也與抗氧化活性有關[23]。綜上所述，用碳酸二甲酯和檸檬酸鈉從現有TPP體系中獲得的PSP-D在體外表現出良好的自由基清除能力和抗氧化能力。

a-DPPH自由基清除自由活性; b-·OH清除率; c-Trolox當量抗氧化能力測定和鐵離子還原/抗氧化能力測定圖4 PSP-D和PSP-T樣品體外抗氧化活性Fig.4 In vitro antioxidant activities of the PSP-D and PSP-T

3 結論

本研究采用碳酸二甲酯和檸檬酸鈉組成的TPP體系，從螺旋藻多糖粗提液中萃取分離PSP-D。在碳酸二甲酯與多糖粗提液體積比為0.6∶1.0、檸檬酸鈉質量濃度為0.18 g/mL、溫度30 ℃、pH 6.0的優化條件下，PSP-D的最大萃取得率為(11.90±0.12)%，其含糖量高于叔丁醇和硫酸銨形成TPP制備的PSP-T。二者具有不同的化學組成和分子量，但其主要結構特征沒有改變。此外，體外抗氧化實驗表明，PSP-D比PSP-T具有更強的清除自由基和抗氧化能力，因此，新形成的以碳酸二甲酯為溶劑的TPP體可取代叔丁醇為溶劑的TPP體系，可獲得較高得率和含量的多糖。