基于脂肪酸組成的茶葉籽油和油茶籽油模式識別分析

張繼光，吳萬富，呂世懂*

1(昆明市糧油飼料產品質量檢驗中心，云南 昆明，650118)2(云南省糧油產品質量監督檢驗站，云南 昆明，650118)3(云南昆明國家糧食質量監測站，云南 昆明，650118)

茶籽主要包括油茶(CamelliaoleiferaAbel.)樹和茶樹(CamelliasinensisO.ktze)的種子，均屬于茶科(Theacease)、山茶屬(Camellia)多年生木本油料植物。油茶和茶樹在我國的分布較廣泛，長江以南的地區分布居多，比如湖南、江西，云南、貴州，四川、浙江等地[1-2]。茶籽油主要是從油茶樹和茶葉樹的種子中提取出來的，油茶樹的種子制取的油叫做油茶籽油，茶葉樹的種子制取的油叫做茶葉籽油。油茶籽油中油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸含量高達80%以上，與橄欖油的脂肪酸組成及含量較接近；而茶葉籽油是近幾年興起的一種特色植物油，其營養成分豐富，含有茶多酚、維生素E、甾醇、山茶苷等多種活性成分，不飽和脂肪酸含量也較高。由于茶葉籽油產量低，營養價值豐富，被稱為“油黃金”。由于油茶籽油和茶葉籽油都是通過山茶屬的植物種子制取而來，因此在大多數報道中，經常把2種油都統稱為茶籽油，實際上它們是有所區別的，由于受產量和營養成分等的影響，2種茶籽油在價格上也存在一定的差異，同時這2種茶籽油在外包裝產品標準的標識上還存在著混淆，本來是油茶籽油的，執行的卻是茶葉籽油標準，反之亦然，所以2種茶籽油在研究和生產中還存在問題。

脂肪酸為油脂的主要成分，包括“飽和”與“不飽和”脂肪酸，在很大程度上決定著油脂的性質[6]。模式識別分析方法是將數學和計算機應用于化學的一門新興的交叉學科，對化學實驗所獲得的大量數據進行歸類和篩選，揭示隱含于這些數據中的規律，從中提取有用信息來說明實驗結果，已被廣泛應用于各種不同產地和類型食品的判別分析。其中應用較多的主要包括主成分分析、聚類分析和偏最小二乘判別分析[7-11]。

目前，基于脂肪酸組成對茶葉籽油和油茶籽油進行模式識別分析方法的研究報道還較少。本研究結合油茶籽油和茶葉籽油的脂肪酸組成及含量，利用模式識別分析方法進行判別分析，并找出能區分它們的關鍵脂肪酸，以期為其鑒定提供理論和技術指導，同時為山茶屬油料作物的開發提供理論基礎，也為其他不同類型油脂的區分與比較提供分析手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

7種茶葉籽油(編號A1-A7)和7種油茶籽油(編號B1-B7)購于不同生產廠家，均為成品油，生產年份均為2019年，詳細信息見表1。

表1 茶葉籽油和油茶籽油樣品信息Table 1 The sample information of camellia seed oils and oil-tea camellia seed oils

1.1.2 標準品和試劑

37種脂肪酸甲酯混標,美國Sigma公司,異辛烷、NaSO4、KOH、甲醇均為分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司;KHSO4(分析純)，天津市光復精細化工研究所;KOH甲醇溶液(2 mol/L)的配制方法：將13.1 g KOH溶于 100 mL甲醇中，輕微加熱，加入無水Na2SO4干燥，過濾，即得澄清溶液。

1.2 儀器與設備

Trace 1310氣相色譜儀〔配有氫火焰離子化檢測器(FID)及Chromeleon7數據處理系統〕,美國Thermofisher Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脂肪酸組成的測定

脂肪酸組成的測定按照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》第三法進行[12]。實驗具體過程：稱取油脂樣品 60.0 mg 至10 mL玻璃離心管中，加入 4 mL 異辛烷溶解油樣，緊接著加入200 μL KOH甲醇溶液，蓋上塞子，在渦旋混勻器上猛烈振搖30 s后靜置至澄清。加入1 g KHSO4，在渦旋振蕩器上充分混搖，待上清液澄清后，將上層溶液過0.22 μm的尼龍膜后移入進樣瓶上機測定。茶籽油中脂肪酸的含量按公式(1)計算:

(1)

式中：Yi，試樣中某個脂肪酸占總脂肪酸的百分比，%；ASi，試樣測定液中各脂肪酸甲酯的峰面積；FFAMEi-FAi，脂肪酸甲酯i轉化成脂肪酸的系數(詳見GB 5009.168—2016[12]的附錄D)；∑ASi，測定出來的所有脂肪酸甲酯的峰面積之和。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：TR-FAME柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱：初始溫度100 ℃， 保持0.2 min，然后以2 ℃/min 升到240 ℃，保持 15 min；載氣為高純氮氣 (純度 99.999%)；流速 0.7 mL/min。進樣口為SSL進樣口，溫度為240 ℃，進樣為分流模式，分流比為100∶1；檢測器溫度250 ℃，氫氣 35 mL/min，空氣 350 mL/min，尾吹氣氮氣40 mL/min。

1.4 數據處理

每個樣品的脂肪酸組成的數據均重復測定2次，均以平均值表示，雙試驗誤差應在GB 5009.168—2016[12]規定的誤差范圍內。顯著性差異分析(獨立樣本T檢驗，P≤0.05)使用SPSS 20.0統計軟件，模式識別分析方法采用SIMCA-P15 (Umetrics, Sweden)軟件。

2 結果與分析

2.1 兩種茶籽油脂肪酸成分分析

按照1.3小節的方法和條件，分別對14個樣品的脂肪酸組成進行分析，其中37種脂肪酸甲酯混標的色譜圖如圖1所示，茶葉籽油和油茶籽油脂肪酸組成的色譜圖如圖2和圖3所示，脂肪酸組成的測定結果和統計分析結果見表2。

圖1 37種脂肪酸甲酯混標的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatograms of 37 mixed fatty acid methyl esters

圖2 茶葉籽油(編號A1)脂肪酸甲酯的氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of fatty acid methyl esters in the Camellia seed oil (No. A1)

圖3 油茶籽油(編號B1)脂肪酸甲酯的氣相色譜圖Fig.3 The gas chromatogram of fatty acid methyl esters in the oil-tea Camellia seed oil (No.B1)

由圖1可知，37種脂肪酸甲酯均能實現良好分離，說明所使用的儀器條件是可行的。由表2可知，在14種茶籽油中共檢出脂肪酸14種，主要為油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸、花生一烯酸等，其中油酸和亞油酸的含量最高，兩者之和分別占茶葉籽油脂肪酸總含量的80.2%和油茶籽油總含量的89.1%。發現2種不同類型的茶籽油在脂肪酸組成上較為接近，但在脂肪酸含量上具有差異性，主要表現在油酸、亞油酸、棕櫚酸等有較大的差異。另外，7個油茶籽油均沒有檢出豆蔻酸，而7個茶葉籽油中也均沒有檢出二十四烷酸，當然這2種脂肪酸并不是各自特有的特征脂肪酸，因為它們的含量太低，而且在一些茶葉籽油也沒有檢出豆蔻酸，而在一些油茶籽油中也沒有檢出二十四烷酸。茶葉籽油中亞油酸平均含量為20.2%，明顯高于油茶籽油(8.78%)，而油茶籽油中油酸的平均含量為80.3%，明顯高于茶葉籽油(60.0%)。除了油酸和亞油酸，棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生一烯酸和二十四碳一烯酸也具有顯著差異。

2.2 基于茶葉籽油和油茶籽油的化學計量學分析

2.2.1 PCA和CA

PCA是將多個變量通過線性變換選出較少個數重要變量的一種多元統計分析方法，它研究的是如何通過少數幾個主成分來揭示多個變量間的內部結構，即從原始變量中導出少數幾個主成分，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，且彼此間互不相關[13-14]。CA又稱群分析，是根據“物以類聚”的道理，對樣品或指標進行分類的一種多元統計分析方法，討論的對象是大量的樣品，要求能合理地按各自的特性來進行分類，沒有任何模式可供參考或依循，即是在沒有經驗知識的情況下進行的[15-17]。將茶籽油的脂肪酸含量表(表2)輸入多元統計學軟件中進行分析，得到主成分得分圖如圖4所示，各變量載荷圖如圖5所示，聚類分析結果如圖6所示。

表2 七種茶葉籽油和七種油茶籽油脂肪酸組成測定結果 單位：%Table.2 The test results of fatty acid composition in seven Camellia seed oils and seven oil-tea Camellia seed oils

圖4 茶葉籽油和油茶籽油的主成分得分圖Fig.4 PCA score scatter plot of the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

由圖4可知，油茶籽油和茶葉籽油之間有一個明顯的區分，油茶籽油聚在了左邊，而茶葉籽油聚在了右邊。從圖6可知，2種茶油實現了各自的聚類，這說明基于2種茶籽油中的脂肪酸含量，通過PCA和CA可以實現這2種茶油的區分。由圖5可知，所有變量都比較分散，難以發現有價值的信息。因此，利用正交偏最小二乘判別分析(orthofonal partial least squares dissromination analysis,OPLS-DA)來進行下一步實驗。

圖5 基于主成分分析的茶葉籽油和油茶籽油脂肪酸變量載荷圖Fig.5 Loading plot of 14 fatty acids utilized from PCA in the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

圖6 茶葉籽油和油茶籽油的聚類得分圖Fig.6 The cluster score plot of Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

2.2.2 OPLS-DA

不同于PCA和CA的分析方法，OPLS-DA是一種有監督的模式識別方法，在基于對樣品進行人為分組的基礎上，通過建立變量與樣品類別之間的關系模型，來實現對樣品類別的預測以及進一步挖掘變量的手段[18-20]。在PCA模型的基礎上，創建了OPLS-DA模型，得到判別分析的得分圖和S-plot圖，如圖7和圖8所示。

由圖7可知，OPLS-DA得分圖可以區分2種茶油，且聚類效果優于PCA。圖8可知，S形的兩個角的變量可能是2種不同茶油中的典型脂肪酸成分差異物。其中變量6、變量7、變量2等，也就是油酸、亞油酸和棕櫚酸等可能分類貢獻較大。為了具體的看出每一種脂肪酸成分的貢獻，在放大實驗次數為200的情況下，進行2組變量的VIP預測值分析，得到VIP圖(圖9)，導出的VIP數值表，預測值的結果如表3所示。

圖7 基于OPLS-DA的茶葉籽油和油茶籽油的得分圖Fig.7 The OPLS-DA of score scatter plot in the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

圖8 基于OPLS-DA變量的S-plot圖Fig.8 The OPLS-DA of S-plot of 14 fatty acids in the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

圖9 茶葉籽油和油茶籽油的14種脂肪酸VIP預測值圖Fig.9 The VIP predicted values plot of 14 fatty acids in the Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

通常情況下，當VIP值>1時，說明這些化合物可能是導致不同組差異的關鍵化合物。通過圖9和表3的VIP值發現油酸、亞油酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生一烯酸和二十四碳一烯酸的VIP預測值均大于1，說明這幾種脂肪酸可能是2組茶油中差異較大的化合物，對它們的區分起到了關鍵的作用，同時這一結果也和統計學T檢驗所得到的結果相吻合。

表3 茶葉籽油和油茶籽油脂肪酸組成統計分析結果Table 3 Statistical analysis results of fatty acid Composition in Camellia seed oils and oil-tea Camellia seed oils

3 結論

本研究利用氣相色譜法對茶葉籽油和油茶籽油的脂肪酸組成進行了定量分析，并進一步利用模式識別分析方法對這2種茶籽油進行判別分析，以挖掘差異性脂肪酸成分。結果表明,在14種茶油中檢出14種脂肪酸，共有脂肪酸成分12種，主要為油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻酸等。經對比發現，2種茶籽油在脂肪酸組成上基本一致，但在含量上存在差異，主要表現在油酸和亞油酸有較大的差異，這主要與它們來源于不同種的茶樹有關。利用PCA、CA和OPLS-DA技術，2種茶籽油能實現較好的區分，并通過進一步分析發現油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸等7種脂肪酸可能是導致2種茶油實現區分的關鍵特征物。下一步實驗將增加樣品的采集量和分析指標，對2種不同類型的茶籽油的差異進行大樣本的數據研究，同時結合化學計量學方法，對其他關鍵差異信息進行挖掘，以期為我國茶葉籽油的開發利用提供一定的理論參考。