高效液相色譜法測定食品中著色劑和工業染料

郭永輝，趙連興，柯澤華，張紀英*，劉貴巧

1(河北工程大學 生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲，056000)2(邯鄲市食品藥品檢驗中心，河北 邯鄲，056000)

顏色是消費者對食品感官評價的重要指標之一， 隨著時間的改變，食品在生產、貯藏、運輸過程中因化學和物理等原因可改變食品的顏色，為此，化學類色素的使用成為保持食品良好色澤的主要手段[1]。在市場上廣泛應用的化學類色素大多為偶氮類化合物，與天然色素相比價格更低，穩定性更好[2]。但是偶氮類合成著色劑在人體內偶氮還原酶的作用下所釋放的芳香胺具有多重危害，不僅會造成頭痛以及兒童多動癥，甚至可能引發癌癥[3]。堿性橙、酸性橙、堿性嫩黃O等高毒的工業染料與人體接觸以及食用后更是具有“三致”等危害[4-5]。

我國監督檢測部門參考的國家標準GB2760—2014中明確分類了不同食品所允許添加的人工合成著色劑的最大限量，國家發布的食品整治辦[2009]29號文件中將堿性橙、酸性橙、堿性嫩黃O等工業染料列為禁用食品添加劑[6]。但仍有不法商販非法添加，對食品安全造成威脅。

在近年對食品中人工合成著色劑和禁用工業染料的測定方法研究中，張蘭天等[7]采用直接稀釋法對飲料中的人工合成色素進行提取，利用高效薄層色譜法進行測定；YI等[8]利用高效毛細管電泳對食品中色素進行測定；宋新等[9]利用示波極譜法對熟肉中的5種水溶性著色劑進行測定。許多學者利用高效液相色譜法對不同食品基質中的禁用工業染料和人工合成著色劑進行了前處理和測定方法的優化和建立[10-15]。采用固相萃取法，利用高效液相色譜-串聯質譜法對不同基質中的多種禁用工業染料進行方法優化及測定，可提高檢測效率[16-19]。目前，市面上同時應用人工合成著色劑和禁用工業染料的食品主要為液體飲料和腐竹等豆制品，在熟肉制品和醬類中應用較少。我國現行國家標準GB5009.35—2016[20]和GB/T23496—2009[21]則是利用聚酰胺吸附方法和濃縮提取法對著色劑和工業染料進行提取，其前處理過程復雜，樣品回收率低，并且國標中聚酰胺吸附法不適用于腐竹等豆制品的提取和測定。國家禁用工業染料及著色劑的測定已分別制定了不同的標準，但只針對一種或幾種色素的提取使用，則較為繁瑣，無法對樣品同時提取并兼顧10種色素測定條件，耗時耗力。因此，建立一種同時測定著色劑和禁用工業染料的快捷且便利的高效液相色譜法顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備

UltiMate 3000高效液相色譜儀配DAD檢測器，自動進樣器，柱溫箱；冷凍高速離心機，賽默飛世爾科技中國有限制公司；Agela Venusil XBP-C18色譜柱，博納艾杰爾科技；MIULAB多管渦旋混合儀，杭州米歐儀器有限公司；超純水機，濟南太平瑪環保設備有限公司；200 g快速開蓋萬能高速粉碎機，上海比朗儀器有限公司；流動相過濾器，津騰；KQ-250DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；0.45 μm PTFE濾膜，津騰。

1.2 化學試劑

甲醇，正己烷(色譜純)、德國默克；乙酸銨、乙酸鋅(均為分析純),天津市永大化學試劑有限公司；亞鐵氰化鉀(分析純)，天津市標準科技有限公司；超純水；胭脂紅(1 mg/mL)、日落黃(1 mg/mL)、誘惑紅(1 mg/mL)、酸性紅(1 mg/mL)、亮藍(1 mg/mL)，中國科學計量院；堿性橙2(0.25 g)、堿性橙21(0.25 g)、堿性橙22(0.25 g)、酸性橙2(0.25 g)、堿性嫩黃O(0.25 g)，北京曼哈格。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取1.2小節中的固體標準品，用1∶1甲醇水溶解并定容，配制為1 mg/mL單個標準溶液。移取適量單標溶液，用1∶1甲醇水定容，配制為100 μg/mL的10種混合標準儲備液。

標準曲線：準確移取100 μg/mL混合標準溶液，配制質量濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 μg/mL的標準系列溶液。

1.4 沉淀劑的配制

亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6 g亞鐵氰化鉀，用純水溶解并定容至100 mL[22]。

乙酸鋅溶液：稱取21.9 g乙酸鋅，加純水溶解并定容至100 mL[22]。

1.5 色素提取方法

飲料類：準確稱取5.00 g樣品，含二氧化碳的飲料在50 ℃水浴條件下超聲30 min，驅除二氧化碳和乙醇，使用80%甲醇水提取色素，定容至25 mL，超聲20 min，放置渦旋儀渦旋2 min，含有固體果粒的飲料需使用離心機離心。取上清液經0.45 μm濾膜過濾，上機。

配制酒類：準確稱取5.00 g樣品，50 ℃水浴聲條件下超聲30 min驅除乙醇，用80%甲醇水提取色素，定容至25 mL，超聲20 min，放置渦旋儀渦旋2 min。取混合溶液經0.45 μm濾膜過濾，上機。

干制豆制品類：取適量干制豆制品至高速粉碎機粉碎，準確稱取1.00 g樣品，加入1.4小節中2種沉淀劑各0.5 mL，用80%甲醇水定容至25 mL，超聲20 min,放置旋轉振蕩渦旋器70 r/min渦旋約2 min，將低溫冷凍離心機設置為9 000 r/min，4℃，離心4 min。取上清液經0.45 μm濾膜過濾，上機。

1.6 色譜條件

Agela Venusil XBP-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) 色譜柱；堿性橙2、堿性嫩黃O’波長為449 nm；堿性橙21、堿性橙22、酸性橙2波長為485 nm；胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性紅波長均為254 nm；亮藍波長628 nm；流動相20 mmol/L醋酸銨溶液-甲醇(梯度洗脫條件見表1)；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；流速1.0 mL/min。

表1 5種人工合成著色劑和5種禁用工業染料的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures for 5 synthetic colorants and 5 prohibited industrial dyes

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

實驗根據1.6小節中所優化的色譜條件對同等性能的C18色譜柱，分別為SUNTEKTM YWG-C18(250 mm×4.6 mm, 10 μm) 色譜柱、OMNI Hubble-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) 色譜柱、Agela Venusil XBP-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) 色譜柱進行比對。因生產廠家不同、色譜柱固定相填料規格大小、內徑不同、裝填人員不同等產生的偶然性差異對試驗的準確性均會有一定的影響。當使用OMNI Hubble-C18色譜柱時，除酸性橙和堿性橙21以外其他目標峰分離良好，但酸性橙2和堿性橙21分離度未達到1.5，未滿足方法學試驗系統適應性要求；當使用SUNTEKTM YWG-C18時，只有5種目標物出峰；使用Agela Venusil XBP-C18色譜柱時，10種目標物在25 min內完全出峰，分離度均>1.5，無拖尾。故選擇Agele Venusil XBP-C18色譜柱進行分離測定(3種色譜柱分離度對比見圖1、圖2和圖3)。

圖1 SUNTEKTM YWG-C18色譜圖Fig.1 SUNTEKTM YWG-C18 column

圖2 OMNI Hubble-C18色譜圖Fig.2 OMNI Hubble-C18 column

圖3 Agela Venusil XBP-C18色譜圖Fig.3 Agela Venusil XBP-C18 column

2.2 柱溫的影響

分別選取20、25、28、30、35 ℃進行試驗。柱溫為30 ℃時，胭脂紅、日落黃、誘惑紅均未出峰；柱溫為28 ℃時胭脂紅、日落黃、誘惑紅出峰極不穩定，由此可見除柱溫箱設置溫度外，外界環境溫度也有一定影響；柱溫為20 ℃時，酸性橙2和堿性橙21出峰重合；柱溫為25 ℃和35 ℃時出，10種目標物均可出峰，但考慮到較高的溫度對色譜柱使用壽命有一定的影響，故選擇25 ℃為最佳試驗溫度。

2.3 提取溶劑的選擇

利用直接萃取法對萃取溶劑進行對比。直接萃取法與現行國家標準中提取著色劑使用的聚酰胺吸附法及提取禁用工業染料的濃縮萃取法相[20-21]比，前處理便捷，兼顧了10種色素的提取率。由于實驗中測定的5種水溶性人工合成著色劑(胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍、酸性紅)和5種禁用工業染料(堿性嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙2)在水和醇類試劑中提取效果差異較大，為了保證良好的提取效果，根據國家標準[20-21]，以及其他檢驗方法[11-18]設定不同的溶劑及提取比例。選取空白含量的液體果茶為基質，配制7種提取溶劑。分別稱取14份樣品各5.0 g至50 mL離心管中進行加標試驗，每種2個平行樣比對，分別加入25 μg/mL標準溶液各1 mL，并用相對應的提取溶劑定容至25 mL。根據7種溶劑提取回收率發現，酸性紅、誘惑紅和酸性橙2在7種提取溶劑中提取效果比較穩定。隨著甲醇比例的降低，堿性橙21、堿性橙2、堿性橙22、堿性嫩黃O四種極性較弱的化合物提取效果較差，回收率逐漸降低。但水溶液比例增大時，對極性較強的水溶性著色劑比較友好；反之，當只使用色譜純甲醇進行提取時，極性較強的水溶性化合物提取效果較差，回收率較低，但堿性橙21、堿性橙2、堿性橙22、堿性嫩黃O等極性較弱的化合物提取效果較好。當使用氨化甲醇[20]進行提取時，堿性嫩黃O和堿性橙22提取效果較差，回收率較低；當使用甲醇∶水(7∶3)為萃取溶劑時，堿性橙22回收率較低；經過比對，甲醇∶水(8∶2)時，10種化合物回收率均在85%以上，故選擇80%甲醇水作為最終試驗提取溶劑(7種提取溶劑回收率比對結果見表2)。

表2 七種提取溶劑加標回收率 單位：%Table 2 The recovery results of the 7 extraction solvents

2.4 蛋白沉淀劑添加量的影響

當前國家標準中對豆制品中著色劑提取方法還未完善。實驗采取溶劑萃取后進行蛋白沉淀處理，由于豆制品基質復雜，含有大量的大豆蛋白，若不對蛋白質進行沉淀而上機檢測，容易有較多的雜質，干擾降低其準確性，造成色譜柱堵塞從而減短色譜柱使用壽命，故對豆制品進行蛋白質沉淀處理減少雜質干擾。根據2.4小節中以果汁為基質得出最佳提取溶劑為80%甲醇水，選取空白含量腐竹粉粹后作為基質，以亞鐵氰化鉀和乙酸鋅溶液為沉淀劑，對腐竹中的大豆蛋白進行沉淀。分別稱取6份樣品分為3組，進行加標，每組包括加標樣品與加標平行樣品進行對照，3組分別添加沉淀劑量0.5、1.0、2.0 mL(結果見圖4)。根據圖4中3組對比得出結論，當沉淀劑添加量逐漸加大時，測定組分的回收率有一定幅度的降低。當選擇加入0.5 mL沉淀劑時，回收率超過75%，故選擇2種沉淀劑的添加量為0.5 mL。

圖4 沉淀劑不同添加量回收率對比Fig 4 Comparison of recovery rate of different precipitants added

2.5 方法學驗證

根據每種組分的截距和斜率計算得出線性回歸方程，線性范圍見1.3小節中配制出的標準系列點建立標準曲線，得出每種測定組分相關性均>0.999，顯示線性良好。以S/N=3為基準，得出方法檢出限，以S/N=10為基準，得出方法定量限結果見表3。根據公式(1)計算出樣品最終含量。

表3 線性回歸方程、相關系數、線性范圍、檢出限、定量限Table 3 Linear regression equation, correlation coefficient, linear range, detection limit, quantification limit

(1)

式中：x，試樣中各組分的含量；mg/kg；ρ，試樣溶液各得測組分的濃度，μg/mL；V，試樣提取液的體積，mL；m，試樣的質量，g。

以茶飲料為基質，分別取1、5、10 mg/kg三個點進行加標，計算其回收率，10種組分平均回收率均>85%；日內精密度RSD值為0.76%～4.10%，日間精密度RSD為1.09%～5.29%(結果見表4)。結果表明儀器重復性及再現性良好。

表4 平均回收率、日內精密度(n=6)、日間精密度(n=6)Table 4 Average recovery rate, intra-day precision (n=6), inter-day precision (n=6)

3 結論

本研究建立了對飲料、配制酒及干制豆制品中的5種偶氮類著色劑和5種工業染料同時測定的高效液相色譜法，對3種不同類型的食品前處理方法及測定的色譜條件進行優化，對當前國標中未能對食品中著色劑和工業染料同時提取這一缺點進行了研究。與我國現行國家標準相比，前處理過程更加便捷，回收率良好，大大的節省時間與耗材，根據方法學驗證表明結果準確且靈敏度高，為檢測食品中色素含量提供了可靠依據。