核酸適配體生物傳感器在食源性致病菌檢測中的應用

曾慧君，付詩慧，晏濤，楊小平，劉萍，徐瑋，董秋花，酈娟

(武漢食品化妝品檢驗所，湖北 武漢，430012)

食品安全主要受到食源性致病微生物及其產生的生物毒素、抗生素、重金屬及農獸藥殘留等威脅，其中食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因[1]。據全國食源性疾病監測信息資料顯示，我國每年由食源性致病菌引起的食物中毒人數約占各類患食源性疾病總人數的40%～60%。對公眾健康造成威脅的食源性致病菌主要包括沙門氏菌、致病性大腸桿菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌及毒素、彎曲桿菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌、結腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌等。對食源性致病菌的快速準確檢測是及時避免有害食品流入消費領域的重要保障。目前食源性致病菌的常規檢測方法多依賴于對微生物的培養與鑒定，準確可靠，但往往費時費力。隨著分子檢測技術的發展,基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)的分子檢測技術因其簡單、快速被廣泛應用于食源性致病菌的檢測，然而該技術存在一定的局限性，一方面，很難區分食品中的死菌和活菌，另一方面，食品基質復雜，若含有干擾或抑制PCR的成分，則容易出現假陰性或假陽性的結果。此外，PCR技術大多依賴專業的操作或儀器，成本較高，難以滿足實際需求。

基于核酸適配體(aptamer)的生物傳感器是目前很有前景的一類可用于食源性致病菌檢測的技術。該技術基于單鏈核苷酸形成的二級或三級結構與靶物質發生高親和性、高特異性的結合進行檢測。由于核酸適配體易于化學合成，結構多樣，其有望實現食源性致病菌快速、簡單和低成本的檢測。

1 核酸適配體及其特點

核酸適配體是一類長度在25～90 bp左右的單鏈DNA或RNA，這些寡鏈核苷酸通過堿基分子間的氫鍵作用形成各種二級或三級結構，與靶標發生高親和性和高特異性結合。作為一種分子識別元件，適配體既可以識別蛋白、核酸以及其他單一分子，還可以識別大分子復合物，比如細胞碎片、細胞、細菌、寄生蟲、病毒等。適配體具有親和力高、特異性強、分辨力高、靶標范圍廣及篩選過程簡單等特點，被譽為“人工抗體”[2]。與傳統抗體相比，作為新型的分子識別元件，核酸適配體具有熱穩定性好、保存期長、無免疫原性、活性均一、變性后可復性、無需利用動物作為反應器生產等優點。

2 核酸適配體的篩選方法

指數富集的配體系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)是目前應用范圍最廣的核酸適配體篩選技術。SELEX篩選技術的主要流程為：(1)化學合成具有一定長度的隨機單鏈核苷酸(ssDNA或RNA)文庫，文庫中的分子形成各種二級或三級結構；(2)將文庫分子與靶標分子混合孵育，部分核苷酸與靶標結合，去除未結合或結合較弱的寡核苷酸；(3)將與靶標結合的核苷酸鏈分離并收集，通過PCR或RT-PCR對收集到的核苷酸鏈進行擴增制備次級單核苷酸文庫；(4)重復步驟(2)(3)對次級文庫進一步篩選，通過多輪的篩選最終獲得與靶標結合的核苷酸適配體富集庫；(5)最后經過測序篩選到適配體序列并進行親和力和特異性的效應評價，獲得能對靶標有效識別的適配體[3]。

由于傳統SELEX技術需經數輪篩選才能得到合適的核酸適配體，周期約為1～3個月，耗時較長，而NON-SELEX篩選技術因其篩選周期短逐漸受到人們的關注。與傳統SELEX技術相比，NON-SELEX技術不需要PCR擴增，只需進行2～3輪的分離、分析進而篩選得到合適核酸適配體。最先提出NON-SELEX篩選技術的是BEREZOVSKI研究團隊，其利用該技術篩選得到h-RAS蛋白的核酸適配體。非平衡毛細血管電泳是一種典型的NON-SELEX篩選技術，將靶物質與適配體文庫形成的平衡混合物作為樣品，靶物質與核苷酸序列結合并形成特征性峰形，進而可求解非線性擬合對反應解離速率常數，通過2～3輪分離、分析即可得到目標核酸序列。值得注意的是，基于毛細血管電泳的NON-SELEX技術，需要篩選靶物質能在結合核酸前后發生較大的電泳遷移，因此NON-SELEX技術主要適用于大分子物質適配體篩選。

除經典的SELEX技術外，一些更高效的SELEX技術也在發展和應用。如將人工擴展的遺傳信息系統(artificially expanded genetic information system, AEGIS)與SELEX技術結合，創建的AEGIS-SELEX技術。傳統的SELEX技術所用隨機核酸序列通常為含ATCGU堿基的天然核糖核苷酸，將一些含非天然堿基(如K,X,Z,P等)的核糖核苷酸引入適配體中增加了適配體的序列多樣性，極大擴展了適配體的空間結構[4]。

3 食源性致病菌的核酸適配體

食源性致病菌的核酸適配體的篩選靶標主要為全細胞(Whole-cell SELEX)、表面組分和代謝產物。Whole-cell SELEX中的靶分子全部處于天然構象中，可以降低處理靶標構象的復雜性，此外Whole-cell SELEX無需將細胞固定在支撐物上。與Whole-cell SELEX相比，以表面特異性組分和代謝毒素作為靶標具有實驗周期短、能夠明確與食源性致病菌的結合位點等優勢。但后者也存在一些缺點：如被篩選的組分與毒素不能保持其在完整細胞里的天然構象，使得篩選得到的適配體與完整細胞的結合力較弱。

近幾年我國食品安全監督抽檢及各類風險監測所涉及的食源性致病菌主要包括：大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽胞桿菌和銅綠假單胞菌。本文總結了目前國內外文獻報道的這些食源性致病菌的核酸適配體序列(表1)。

表1 食源性致病菌核酸適配體序列Table 1 Aptamers for the detection of foodborne pathogens

4 食源性致病菌核酸適配體的檢測

篩選到食源性致病菌的核酸適配體后，還需進一步將檢測信號轉換為可識別的輸出信號。核酸適配體可通過生物傳感器進行信號輸出，將核酸適配體固定在生物傳感器的基體上，通過傳感技術使得在吸附過程中的化學、物理、電學或光學的變化轉換成可以檢測的信號。目前應用于核酸適配體的傳感器包括比色傳感器、熒光傳感器、化學發光傳感器、表面增強拉曼光譜傳感器、表面等離子體共振傳感器、流式細胞術傳感器、側向流傳感器、電化學傳感器和壓電晶體傳感器[31-35]。本文介紹了這些傳感器在食源性致病菌核酸適配體檢測的應用。

4.1 比色傳感器

比色傳感器(colorimetric aptasensors)因操作簡便、可視化、便攜等特點受到人們的廣泛關注。SUN等[36]利用G-四聯體DNA酶比色發光傳感器實現對副溶血性弧菌的檢測。副溶血性弧菌核酸適配體序列被固定在磁珠顆粒上，G-四聯體互補序列與核酸適配體序列緊密結合形成DNA雜交鏈。副溶血性弧菌存在時，會與適配體序列相結合，G-四聯體互補序列將會被釋放出來，在650 nm波長下催化底物TMB和H2O2呈藍色。在合適條件下，檢測限能達到10 CFU/mL，該方法能有效檢測被污染三文魚樣品中的副溶血性弧菌。WU等[37]研發出用來檢測鼠傷寒沙門氏菌的比色傳感器，該技術利用金屬氧化物納米材料ZnFe2O4/rGO的類過氧化物酶活性進行催化反應，此方法的檢測限為11 CFU/mL，檢測范圍11～1.1×105CFU/mL，可用于牛奶中鼠傷寒沙門氏菌的檢測，結果顯示與傳統微生物檢測法的結果無顯著差異。

納米金(AuNP)傳感器是另一種無需特殊標記的生物傳感器。MA等[38]利用沙門氏菌適配體和納米金構建納米金-適配體傳感器，加入沙門氏菌液后，適配體與沙門氏菌特異性結合，納米金顆粒被釋放出來。再加入NaCl溶液后納米金顆粒發生團聚，引起溶液顏色變化從而實現沙門氏菌的可視化檢測，檢測限可達56 CFU/mL，該研究組將此方法用于牛奶中目標菌的檢測，檢測限為69 CFU/mL。KIM等[39]在最新研究中利用納米金傳感器實現了對雞肉中空腸彎曲桿菌和大腸彎曲桿菌的快速檢測，將檢測時間縮短至30 min。JIA等[30]在40 min內利用該傳感器技術完成了銅綠假單胞菌的檢測，在雞肉和水樣中目標菌的回收率為92.4%～108.9%。

4.2 熒光傳感器

熒光傳感器(fluorescence aptasensors)以熒光基團/熒光納米顆粒標記核酸適配體，靶標與適配體結合后會產生熒光偏振信號或改變熒光強度，通過信號變化來檢測靶標。方順燕等[40]近期提出一種基于倏逝波熒光原理的大腸桿菌 O157∶H7的快速檢測方法,將一定濃度熒光標記的核酸適配體加入樣品檢測池，倏逝波激發熒光分子發出熒光，利用倏逝波全光纖生物傳感器實現熒光信號的定量檢測，此方法的檢測限為610 CFU/mL，檢測范圍為1.1×103～1.4×107CFU/mL?？捎糜谒畼又写竽c桿菌 O157∶H7的檢測，目標菌的回收率在40%～180%。

量子點(quantum dots，QDS)是一種近似球形的高效熒光納米晶體。LI等[41]以三甲基硅氧烷、γ-Fe2O3和熒光量子點作為基質組分，組裝成多熒光磁性多功能納米探針(FMNPs)，與適配體結合后形成復合物apt-FMNPs識別體系，能同時檢測大腸桿菌 O157∶H7和鼠傷寒沙門氏菌，檢測限分別為16 CFU/mL和25 CFU/mL，可用于牛奶中目標菌的檢測，對牛奶樣品中大腸桿菌 O157∶H7和鼠傷寒沙門氏菌的檢測限分別為100 CFU/mL和150 CFU/mL。

4.3 化學發光傳感器

化學發光是物質在進行某些化學反應時產生的光輻射現象。目前常見的化學發光適配體傳感器(chemiluminescence aptasensor)是在核酸適配體上標記化學發光因子，或是在體系中引入相關元件進行發光反應。HAO等[31]建立了一種基于滾環擴增的化學發光適配體傳感器用于檢測金黃色葡萄球菌，該方法以Co2+/ABEI-AuNFs納米顆粒復合物為供體，WS2納米片為受體，供體與受體結合將引起化學發光共振能量轉移，產生信號猝滅。當金黃色葡萄球菌存在時，與適配體結合會啟動滾環擴增反應，擴增產物cDNA與Co2+/ABEI-AuNFs結合形成cDNA-ABEI-AuNFs,WS2受體被釋放出來，從而抑制化學發光能量轉移的發生，通過對輸出信號的變化實現對金黃色葡萄球菌的檢測分析。在最佳條件下，菌液濃度為50～1.5×105CFU/mL時，金黃色葡萄球菌與信號強度呈線性相關(R2=0.9913)，檢測限為15 CFU/mL。該研究組利用相同的技術原理開發出適用于鼠傷寒沙門氏菌的化學發光傳感器檢測方法[42]，檢測限為10 CFU/mL。這2種方法均可用于豬肉中目標菌的檢測，對豬肉中金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢測限分別為150 CFU/mL和100 CFU/mL。

4.4 表面增強拉曼光譜傳感器

表面增強拉曼光譜(surface enhanced raman spectroscopy, SERS)是基于被測分子吸附在某些經特殊處理、具有納米結構的金屬表面具有極強拉曼散射增強效應的分子振動光譜技術。DUAN等[43]最近研發出一種新的SERS傳感器方法用于多種食源性致病菌的快速檢測。用納米金顆粒修飾聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)膜作為增強拉曼散射的活性基質，與適配體(apt)結合后形成apt-Au-PDMS復合物，該復合物作為特異性的SERS探針可同時檢測副溶血性弧菌和沙門氏菌，檢測限分別為18 CFU/mL和27 CFU/mL。利用該技術平臺成功檢測海鮮樣品如三文魚、牡蠣和蝦中的副溶血性弧菌和沙門氏菌，目標菌的回收率為82.9%～95.1%。LI等[44]建立的SERS適配體傳感器對副溶血性弧菌的檢測方法靈敏度極高，檢測限低至1 CFU/mL，在水樣中目標菌的回收率在95%～107%。

4.5 表面等離子體共振傳感器

表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)適配體傳感器是在等離子共振裝置表面上修飾一層適配體，無病原菌結合情況下，入射光以臨界角入射,由于能量共振轉移使反射光大大減弱;有病原微生物與適配體結合時離子共振裝置的折射率就會發生位移，反射光會發生變化，通過對光變化信號的檢測可以判定檢測物中是否有目標病原菌存在。XU等[45]設計了一種新型的Ω形局部光纖探針表面等離子體共振(FOLSPR)生物傳感器用來檢測鼠傷寒沙門氏菌，菌液濃度為5.0×102～1.0×108CFU/mL時，鼠傷寒沙門氏菌與信號強度呈良好線性相關，檢測限為128 CFU/mL。FOLSPR檢測方法可成功用于雞肉中鼠傷寒沙門氏菌的檢測，目標菌的回收率為85%～123%。

4.6 流式細胞術傳感器

流式細胞術(flow cytometry, FCM)與核酸適配體相結合可實現對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌等致病菌的檢測。該體系的原理是將核酸適配體進行熒光標記，用流式細胞儀對靶標的熒光信號進行定性、定量檢測分析。DUAN等[35]利用FCM建立起對副溶血性弧菌和沙門氏菌的同時檢測技術，將副溶血性弧菌和沙門氏菌分別用量子點進行標記，當副溶血性弧菌存在時，將與量子點結合發綠色熒光,而沙門氏菌與存在的量子點結合后發橙色熒光，最后通過FCM對熒光信號進行定性、定量檢測。該方法中副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢測范圍分別為3.4×104～3.4×107CFU/mL 和3.8×104～3.8×107CFU/mL，檢測限為5×103CFU/mL，可在蝦樣品中對目標菌進行特異性定量檢測。董曉琳等[46]以金黃色葡萄球菌為研究對象，建立核酸適配體流式細胞術檢測體系，該體系能在混合菌中準確快速鑒別出金黃色葡萄球菌，僅用時40 min。

4.7 側向流傳感器

側向流生物傳感器(lateral flow aptasensors，LFA)是將側向流動型試紙(lateral flow strips, LFS)與核酸適配體相結合的技術，該技術整合了LFS和適配體在分子檢測領域的優勢。WU等[47]建立了一種基于雙適配體的LFA用于檢測副溶血性弧菌。當副溶血性弧菌存在時，會形成a-適配體/靶標/c-適配體/MBs復合物結構。將復合物作為等溫擴增的模板，擴增后的單鏈被固定到LFS上進行測定,可以在55 min內完成。在最佳條件下，該體系的檢測限可低至5.6 CFU/ml，可成功用于牡蠣中副溶血性弧菌的檢測，目標菌的回收率為89.6%～110.5%。FANG等[32]設計了2種沙門氏菌核酸適配體元件，當靶標沙門氏菌存在時，將與雙適配體結合形成復合物。隨后用鏈霉親和素修飾的磁珠顆粒捕獲這一復合物，進行等溫鏈置換擴增反應對信號進行放大，擴增產物加入LFA后產生可視化信號。該技術對沙門氏菌的檢測全過程無需提取DNA，檢測限為10 CFU/mL。

4.8 電化學傳感器

將核酸適配體和電化學活性傳感元件結合固定在電極表面，靶標存在時，會與核酸適配體結合導致電極表面變化，通過檢測變化的電化學信號實現對致病菌的定性或定量檢測。ABBASPOUR等[34]建立了一種基于雙適配體的夾心電化學傳感器技術用來檢測金黃色葡萄球菌，該方法的檢測限低至1 CFU/mL，可用于水樣中金黃色葡萄球菌的檢測。HUA等[6]在最新研究中使用非金屬納米材料建立了用于檢測大腸桿菌的電化學適配體傳感器。將碳量子點-石墨烯水凝膠(C-dots/3DGH)和類石墨烯物質氮化碳(g-C3N4)2種材料修飾到ITO電極的2個相鄰區域，通過施加不同偏置電壓，可明顯區分C-dots/3DGH生成的陰極電流和g-C3N4生成的陽極電流，兩者互不干擾。大腸桿菌適配體(apt)被修飾到C-dots/3DGH表面形成apt-C-dots/3DGH，當靶標存在時，大腸桿菌與apt-C-dots/3DGH結合導致空間位阻增大，陰極電流顯著減少，而g-C3N4生成的陽極電流不會受到影響，通過陰極電流和陽極電流的電流比實現對目標菌的定量檢測。該方法中大腸桿菌檢測范圍為2.9～2.9×106CFU/mL，檢測限為0.66 CFU/mL，具有極高靈敏度。可用于牛奶中大腸桿菌的檢測，目標菌的回收率在98.6%～102.0%。

4.9 壓電晶體傳感器

石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)具有靈敏度高、便攜等特點，是最常見的壓電晶體傳感器。壓電晶體在機械力的作用下會發生形態變化，帶電質點將會發生相對位移，因而會在晶體表面出現正負束縛電荷，通過檢測極軸兩端的電勢差進而實現對靶標的檢測。OZALP等[33]將鼠傷寒沙門氏菌的核酸適配體固定在QCM傳感器上，當目標菌存在時，與適配體發生特異性結合引起QCM傳感器產生形變，進而產生電勢差，通過對電勢差信號的檢測來分析鼠傷寒沙門氏菌的含量，檢測限為102CFU/mL，可在牛奶樣品中對鼠傷寒沙門氏菌進行特異性檢測，檢測范圍為102～1.0×104CFU/mL。YU等[10]建立了大腸桿菌O157FCMH7的QCM適配體檢測方法，檢測限為1.46×103CFU/mL，用時僅50 min。

綜上所述，基于核酸適配體的生物傳感器技術在食源性致病菌檢測領域有著很廣泛的應用，具有高特異性和靈敏度，不同的傳感器技術有各自的優缺點，各機構可根據研究需求和實際實驗平臺條件選擇適合的檢測技術(見表2)。

表2 各種核酸適配體生物傳感器的比較Table 2 Comparison of the aptasensors for foodborne pathogen detection

5 結語

核酸適配體具有篩選周期短、易合成、易修飾、高親和性及高特異性等優勢被廣泛應用于藥物篩選、重金屬檢測、疾病診斷治療、食源性致病菌檢測等領域。然而，核酸適配體相關技術在檢測食源性致病菌中仍存在一些缺陷：相較于種類繁多的抗體，針對不同食源性致病菌的核酸適配體種類有限；致病菌的高度變異性以及復雜的結構仍給核酸適配體的高效特異識別造成一定困難；核酸適配體生物傳感器是基于各學科交叉的新型檢測技術，目前對致病菌的研究大多停留在實驗室階段，人工污染樣品的檢測也主要集中在牛奶、肉和水樣中，對其他樣品基質的研究較少；食品基質的多樣性決定食品中很可能含有各種干擾成分，進而影響核酸適配體與靶標致病菌的結合，導致實際檢測樣品時靈敏度降低；目前對于核酸適配體與靶分子的結合位點缺乏系統性的研究和評價手段。因此針對不同種類、不同食品基質中的食源性致病菌，篩選出更為高效、靈敏的適配體是該技術向實際應用轉化的關鍵，可從以下幾方面進行更深入研究：應用新型的篩選技術進一步提高篩選效率，如細胞芯片SELEX、AEGIS-SELEX等；研發各種信號放大手段以進一步提高靈敏度從而減弱由食品基質效應造成的影響；進一步研究核酸適配體與靶標致病菌結合的機制；建立核酸適配體親和性及特異性的計算模型和評價體系；著力探索更為簡便、靈敏、準確的現場快檢技術，如基于核酸適配體的食源性致病菌檢測試紙條、試劑盒等，這些現場快檢技術既能讓企業在生產、加工、運輸各環節更好的對產品進行質量管控和風險管理，也能讓食品安全監管部門有更便利可靠的檢測產品。