飼料中喹乙醇殘留的免疫快速檢測

王敏思，朱文博，柳 雙，張志軍，宋 洋

（1.天津師范大學 生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；3.國家農產品保鮮工程技術研究中心（天津），天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津300384）

喹乙醇（olaquindox，OLA）又稱喹酰胺醇、倍育諾、快育靈，分子式為C12H13N3O4，CAS號為23696-28-8.它是一種生長促進劑，可促進蛋白質合成代謝，提高飼料的能量利用率和禽畜個體瘦肉率[1]，被廣泛用作豬、魚的飼料添加劑以提高飼料轉化效率[2].近年來，喹乙醇被稱為“水產養殖瘦肉精”[3].大量喹乙醇對動物有毒害作用，在動物體內富集會通過食物鏈導致人致畸、致癌和致突變.喹乙醇的毒性因動物種類不同而不同，對家禽和魚類具有顯著的毒性[4]和特定的遺傳毒性[5].因此，歐盟自1999年以來完全禁止使用喹乙醇[6].中華人民共和國農業部批準的國家獸藥標準《中華人民共和國獸醫藥典》和2001年頒布的《飼料添加劑使用標準》明確規定，喹乙醇在養殖業中的使用只能用于體質量不足35 kg的豬，飼料添加量為50 mg/kg，禁止用于家禽和水產養殖的飼料中[7].2018年1月11日，農業部第2638號公告公布，自2018年5月1日起，在養殖業中禁止使用喹乙醇.基于此，建立簡便、靈敏、符合國家最新規定的檢測喹乙醇殘留的分析方法十分必要.

目前，檢測喹乙醇常用的方法有高效液相色譜法（HPLC）[8]（HPLC與質譜聯用[9]）、酶聯免疫吸附實驗（ELISA）[10]、仿生酶聯免疫吸附實驗（BELISA）[11]和定量金免疫層析法[12].2008年Zhao等[10]設計了2種結構抗原，建立了間接競爭性酶聯免疫方法（ic-ELISA）檢測動物飼料中的喹乙醇，2種抗體的靈敏度（IC50）分別為16.0μg/L和19.0μg/L，檢測限（IC15）分別為0.24μg/L和1.02μg/L.2013年Zhao等[11]建立了直接競爭性仿生酶聯免疫吸附測定方法，測定雞飼料中的喹乙醇，IC50和IC15分別為（700.0±60.0）μg/L和（17.0±1.6）μg/L，靈敏度和檢測限相對其他方法較低.2016年Pei等[13]建立了金標免疫層析法（GICA）分析動物飼料樣品中的喹乙醇，IC50為3.35μg/L，回收率范圍為77.33%～86.91%，（變異系數范圍為11.47%～23.62%），盡管GICA方法有較高的靈敏度，但準確性有待提高.

本研究基于實驗室制備的高靈敏度和特異性的喹乙醇多克隆抗體，擬建立雞、魚、豬的3種典型飼料中喹乙醇殘留的快速檢測方法.通過優化及簡化3種樣品的前處理方法，有效縮短前處理步驟和檢測時間，實現對雞、魚、豬飼料實際樣品的高效和快速檢測.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

喹乙醇，加拿大TRC公司；酶標二抗（羊抗鼠），中國上海斯信生物技術有限公司；牛血清蛋白（BSA），生工生物工程（上海）股份有限公司；β-環糊精，德國Merck公司；過氧化氫脲、3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB），美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO），中國J＆K公司；NaH2PO4·2H2O，天津金海華興科技發展有限公司；Na2HPO4·12H2O，天津市大茂化學試劑廠；檸檬酸，成都格雷西亞化學技術有限公司.

pH值為9.6的碳酸鈉緩沖液（包被緩沖液）；PBS（0.01 mol/L磷酸鈉緩沖液，pH值為7.4）；PBST（1 L PBS加0.50 g吐溫）；PBST（1L PBS加0.10 g K2CO3）；PBSB（100 mL PBS+0.1 g BSA）；4.30 mg/mL喹乙醇多克隆抗體（本實驗室合成）；樣品提取液（甲酸和15%甲醇水溶液的體積比為1∶99）.

1.2 儀器與設備

全波長酶標儀（Labsystems），英國雷勃公司；96孔酶標滴定板，丹麥Nunc公司；數顯型酶標板振蕩器，美國IKA公司.

1.3 喹乙醇間接競爭ELISA方法的建立

用包被液稀釋包被原，使每個孔的量分別為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000μg；將酶標二抗分別稀釋2 500、5 000、10 000、20 000倍；將競爭反應時間分別設置為30、40、50、60 min.反應在96孔酶標滴定板中進行，用酶標儀讀取A450nm和A650nm值，根據結果中IC50值的大小和吸光度的變化選擇最佳反應條件.

利用上述得到的優化條件，分別將喹乙醇配制成0.030、0.300、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000μg/kg的溶液，進行ic-ELISA實驗.實驗結果以喹乙醇標準品的質量分數（μg/kg）為橫坐標，以抑制率（inhibition rate，%）為縱坐標繪制標準曲線.

式（1）中：A質控為喹乙醇標準品濃度為零時的吸光度；Ax為喹乙醇標準品濃度為x時的吸光度；A空白為空白孔的吸光度.

1.4 抗體特異性的評估

通過抗原以及其他抗原結構類似物與抗體的交叉反應率（CR）來判斷抗體的特異性[14].

式（2）中：IC50(喹乙醇)為喹乙醇的抑制率為50%時對應的喹乙醇濃度；IC50(其他標準品)為其他標準品的抑制率為50%時對應的標準品濃度.

1.5 樣品的測定

1.5.1 樣品的準備與處理

分別選擇3種飼料（雞飼料、豬飼料、魚飼料）作為樣品去評估ic-ELISA方法的各項性能指標.所有樣品來自當地市場（天津），樣品經HPLC檢測確保其不含喹乙醇.樣品經打磨至均質，備用.

1.5.2 基質影響的消除

魚飼料：精確稱量1.00 g飼料樣品（精確到0.01 g）和0.01 g PSA置于離心管中，加入2 mL樣品提取液，渦旋5 min，10 000 r/min、5℃下離心10 min，取上清液1 mL過0.45μm濾膜，PBS稀釋2倍待測.

豬、雞飼料：精確稱量1.00 g飼料樣品置于離心管中，加入1 mL樣品提取液，10 000 r/min、5℃下離心10 min，取1 mL上清液，用PBST（1 L PBS加0.10 g K2CO3）稀釋3倍待測.

1.5.3 添加回收實驗

利用添加回收實驗評估ic-ELISA方法的準確度.具體步驟如下：分別對3種飼料樣品進行加標回收實驗，每種樣品分別添加3個質量分數（30、100、200μg/kg），每個重復3次.樣品提取液經間接競爭ELISA法分別檢測后，計算其回收率（recovery rate），根據回收率接近100%的程度來檢驗方法的準確度.

1.5.4 實際樣品的檢測

對天津市場的不同品牌飼料進行抽樣調查，每種樣品有6種不同來源，每個樣品有3個平行.

1.6 方法比對實驗

檢測條件及方法參考文獻[15]，樣品處理方法參考文獻[16].稱取5.00 g飼料，加入10 mL提取液（體積分數為5%的甲醇溶液），室溫振蕩45 min，3 000 r/min離心10 min，分離出上清液.取SPE小柱，分別加2 mL甲醇和2 mL水，對小柱進行活化.取2 mL上清液過小柱，分別用0.02 mol/L鹽酸2 mL、5%的甲醇溶液淋洗，最后用2 mL甲醇溶液（體積分數為40%）洗脫.洗脫液過0.22μm有機相濾膜，濾液上機測定.

2 結果與分析

2.1 ic-ELISA方法的建立

本研究對包被原包被量、酶標二抗稀釋倍數以及競爭反應時間進行優化，最終確定的最優條件為：抗體稀釋165 000倍，包被原包被量為0.5μg/well，酶標二抗稀釋10 000倍，抗原抗體競爭反應時間為50min.繪制標準曲線如圖1所示，其中，IC15=（0.6±0.2）μg/L，IC50=（3.2±0.3）μg/L.由圖1可以看出，在0.9～8.0μg/L質量濃度范圍內線性良好.

圖1 喹乙醇抑制曲線Fig.1 Olaquindox inhibition curve

2.2 抗體特異性

利用測定抗體與喹乙醇及其他結構類似物的交叉反應率來評價抗體的特異性.本研究選擇幾種喹乙醇結構類似物和功能類似物進行分析，結果如表1所示.

表1 各化合物與抗體的交叉反應率和IC50值Tab.1 IC50 and CR of some compounds with antibody

由表1可以看出，喹乙醇抗體除了能夠有效識別喹乙醇外，與其他喹乙醇類似物的交叉反應率均較低.由于喹烯酮和乙酰甲喹與喹乙醇有相似的苯環結構，與抗體有一定的親和性，因此喹烯酮交叉反應率為3.00%，乙酰甲喹為2.20%.其他結構類似物（卡巴多、鹽酸克倫特羅、氯霉素）的交叉反應率均小于0.01%.說明該抗體的特異性非常好，能夠有效檢測樣品中的喹乙醇殘留.

2.3 基質影響消除結果

豬、魚、雞的3種飼料樣品經間接競爭ELISA檢測獲得的抑制率曲線和吸光值曲線分別如圖2（a）和2（b）所示.

圖2 喹乙醇間接競爭ELISA標準曲線Fig.2 ic-ELISA calibration curve of olaquindox

抑制率曲線即為樣品的基質曲線.由圖2可以看出，3種飼料的抑制率曲線和吸光值曲線均與標準曲線基本重合，由此可知，樣品的前處理方法基本可以達到消除基質影響的目的.

2.4 添加回收實驗結果

將每種飼料樣品勻漿添加喹乙醇標準品，使其最終質量分數分別為1.0、4.0、8.0μg/kg，每個水平設置3個平行，分別用ic-ELISA和HPLC進行檢測，結果如表2所示.由表2可以看出，ic-ELISA回收率為80.0%～100.0%，變異系數（CV）為2.3%～11.1%；HPLC回收率為70.0%～107.5%，變異系數為1.6%～9.9%.2種方法的檢測結果基本一致，因此認為ic-ELISA方法可以用于飼料樣品中喹乙醇的檢測.豬、雞、魚的3種飼料的檢出限分別為6.0、6.0、4.0μg/kg.

表2 喹乙醇在3種樣品中的添加回收率Tab.2 Recovery of olaquindox in three kinds of samples

2.5 實際樣品測定

分別用ic-ELISA和HPLC方法檢測市售的18件飼料，結果如表3所示.

表3 實際樣品中的喹乙醇的檢測Tab.3 Detection of olaquindox in real samples

由表3可以看出，3種飼料中均檢測出了喹乙醇，總檢出率為50%，但并未超標.豬飼料中檢出的喹乙醇含量都相對較高，雞飼料次之，魚飼料相對比較低.同時發現檢出率較高的是雞飼料，為66.7%；其次是豬飼料，為50%；魚飼料最低，為33.3%.3種飼料中喹乙醇的添加均未超標.

3 結論

本實驗基于ic-Elisa方法，建立了一種快捷、靈敏、準確的飼料中喹乙醇的檢測方法.該方法的IC50為（3.2±0.3）μg/L，IC15為（0.6±0.2）μg/L，線性范圍為0.9～8.0μg/L.雞、魚、豬飼料樣品經提取、離心、稀釋過膜后，其基質影響可基本消除，整個檢測時間僅需2.5 h.通過添加回收實驗和HPLC實驗驗證，該方法有效.3種樣品的實際檢出限分別為6.0、4.0、6.0μg/kg，均低于已報道的其他方法.因此認為，本研究建立的ic-Elisa方法可高效、準確地檢測飼料中的喹乙醇.與以往方法相比，該方法的樣品檢出限更低，可實現雞、魚、豬3種飼料中喹乙醇的精準定性定量分析.