養殖水體Biolog Eco板培養時間對微生物多樣性分析結果的影響

趙 瓊，張峰峰，周 可，孫海波，趙玉潔，謝鳳行

（天津市農業生物技術研究中心，天津300384）

微生物具有豐富的物種和遺傳多樣性，在眾多的微生物多樣性的研究方法中，Biolog Eco法是以研究微生物群落水平生理特征（community level physiological profiling，CLPP）為主的一種方法，由美國BIOLOG公司于1989年建立[1].Biolog Eco方法的原理是微生物在利用碳源過程中產生的自由電子與四唑染料發生還原顯色反應，顏色深淺可以反映微生物群落對碳源的利用程度.由于微生物對不同碳源的利用能力很大程度上取決于微生物的種類和固有性質，因而Biolog Eco板培養后測定各孔的顏色變化即可表征樣品微生物群落的代謝功能多樣性與活性[2].Biolog Eco方法數據量十分豐富，每一孔的吸光度均可作為樣品的1個變量進行分析，且具有方便、快捷等優點，在表征細菌群落動態變化的時空尺度上具有顯著優勢[3-4]，因此被廣泛應用于土壤、水體等環境領域[5-8].由于Biolog Eco方法能提供微生物群落碳代謝潛力的相關信息，因此還可以和高通量測序方法相結合，進行微生物群落結構和代謝功能的相關研究[9-11].

Biolog Eco方法最初是被應用于土壤微生物群落的研究，近年來在海洋、湖泊、河口領域的應用逐年增多[12].Biolog Eco方法的難點在于數據分析，目前進行數據分析的方式主要有3種：①選用特定的培養時間點去分析Biolog Eco的數據[13]；②采用曲線擬合的方法，兼顧Biolog Eco反應前后的變化[14]；③為規避接種密度對分析結果的影響采用固定顏色平均變化率（average well color development，AWCD）時的吸光度值進行分析[15].由于選擇特定培養時間點的方法更簡單易行，目前被國內外學者普遍采用[13].根據不同環境下樣品微生物群落菌體密度和活性的不同，常用于數據分析的培養時間有72[16]、96[17]、120[18]、168[19]和240 h[20].賈夏等[19]研究土壤樣品Biolog Eco板培養時間對分析結果的影響，認為應盡量選擇240 h進行連續讀數全記錄，再根據AWCD曲線“拐點”處或之后的時間進行分析.

養殖水體的異養菌菌體濃度比土壤環境低很多，一般在103～105cfu/mL之間[21-22].Biolog Eco方法在養殖水體中的應用研究也有少量報道，如Kurten等[23]認為，利用處于指數增長期的72 h或96 h進行結果分析較為合適，因為隨著時間的延長群落底物利用特征（community substrate utilization profile，CSUP）的差異程度降低，AWCD曲線進入穩定期后提供的新信息有限.目前缺乏對養殖水體微生物群落代謝功能隨時間變化的相關研究.因此，本研究以鰱魚單養池塘和對蝦精養池塘水樣為研究對象，考察水樣微生物群落的AWCD值、6類碳源利用情況、多樣性指數和主成分分析達到沒有顯著差異的時間點，以及不同時間點對5種水樣的區分情況.本研究可為利用Biolog Eco板開展養殖水體微生物群落功能多樣性研究提供依據，也為Biolog Eco板在其他水體環境中的應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 養殖池塘的選擇及管理

本研究共采集了5個水樣.WS1和WS2水樣取自天津市西青區津靜公路北側魚塘，東經117°05′，北緯39°10′，取樣時間為2018年5月31日.WS1池塘為鰱魚單養池塘，WS2池塘為南美白對蝦精養池塘，2個池塘面積均為4 hm2.2018年5月20日WS1池塘放養鰱魚4 500尾/hm2，WS2池塘放養蝦苗60萬尾/hm2.養殖期間WS1池塘不投喂飼料，WS2池塘投喂蝦飼料.WS3、WS4和WS5水樣均取自天津市西青區畜牧水產局養殖基地南美白對蝦精養池塘，東經117°04′，北緯39°11′，取樣時間為2018年9月10日.3個池塘面積均為0.5 hm2，2018年6月20日每個池塘放養蝦苗30萬尾，養殖期間投喂蝦飼料.表1為5種水樣池塘水質的基本情況和異養菌菌落總數.

表1 池塘水體理化性質和異養菌菌數Tab.1 Physical chemical characteristics and heterotrophic plate count of the water sample in ponds

1.2 樣品采集

用有機玻璃采水器在池塘四周和中心分別采集等量表層水樣（水面以下0.5 m），混和后裝入無菌取樣瓶，每個池塘取2份水樣，低溫保存，帶回實驗室立即開展實驗.

1.3 測定方法

異養菌總數的測定：將所取池塘水樣混和，利用0.85%滅菌生理鹽水進行梯度稀釋，取合適稀釋度的0.1 mL稀釋液涂布營養瓊脂平板，28℃倒置培養3 d計算菌落總數.

Biolog Eco板操作：用0.85%的生理鹽水對水樣進行稀釋，用八道移液器將樣液加入預熱的Biolog Eco板中，每孔加150μL.將加好樣的Biolog Eco板加蓋放入保鮮盒中，25℃培養，每隔24 h利用酶標儀（Elx808，美國Bio Tek公司）讀取各孔在750 nm和590 nm下的吸光度值[24].每個池塘的2份水樣分別加入到Biolog Eco板中，每個Biolog Eco板3個重復，共6個重復.

Biolog Eco板培養時間的優化：將所取水樣以原液加入Biolog Eco板中，記錄24～192 h的吸光度值，計算不同時間點微生物群落的AWCD值、6類碳源利用情況、多樣性指數并進行主成分分析，確定各項指標達到沒有顯著差異的時間點，同時研究不同時間點對5種水樣的區分.

1.4 計算方法

1.4.1 水樣微生物群落平均活性

Biolog Eco板具有96個孔31種碳源，每種碳源設3個重復.用（OD590-OD750）的值表示微生物代謝活性，OD590和OD750的值為加樣孔吸光度值減去相應對照孔的吸光度值，當上述差值為負或小于0.06時修正為0[24].微生物的平均活性采用Biolog Eco孔的AWCD來描述，計算公式如下：

式（1）中：Ci為每個碳源孔測定的兩波段吸光度值的差值；R為對照孔的吸光度值；31為碳源種類數.

1.4.2 多樣性指數分析

采用Shannon-Wiener指數（H′）、Pielou均勻度指數（J）、Simpson指數（D）、McIntosh指數（Dmc）和McIntosh均勻度（E）來描述微生物群落的功能多樣性，計算公式如下[25-26]：

式（2）～式（6）中：ni為每個孔的相對吸光度值即（Ci-R）；N為Biolog Eco板上每個重復區域（32個孔）相對吸光度值的總和即∑（Ci-R）；pi為第i孔相對吸光度值與其相應重復的相對吸光度值總和的比值，即pi=為顏色變化的孔的數目，即Ci-R＞0的孔的數目；在計算Simpson指數時，數據擴大了1 000倍以防止出現負數[25].

1.4.3 碳源利用情況分析

Biolog Eco板含有的31種碳源可以分為6大類，其中氨基酸（amino acids）6種、碳水化合物類（carbohydrates）12種（D-葡萄糖胺酸和D-半乳糖醛酸列入碳水化合物類）、羧酸（carboxyl acids）5種、聚合物（polymers）4種、胺類（amines）2種和酚類2種[5]，計算每類碳源對應孔（OD590-OD750）的平均值，以此表征微生物群落對此類碳源的利用情況.

1.4.4 主成分分析

對5個池塘水樣72～192 h微生物群落的底物利用特征進行主成分分析（principal components analysis，PCA），同時利用主成分分析比較72～192 h時間點對5種水樣的區分.采用協方差矩陣進行主成分分析[27-28].

1.4.5 統計分析

用Excel 2016和SPSS19.0進行數據統計，每種水樣的6組吸光度值數據互為平行[24].AWCD值、6類碳源的利用和多樣性指數均采用單因子方差分析進行差異統計學意義檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義.ANOSIM方法（analysis of similarities）用于主成分分析后微生物群落底物利用特征的差異統計學意義檢驗，SIMPER分析（similarity percentages）用于不同時間群落底物利用特征的差異度分析，2種方法通過PAST Version 3軟件完成[29]，應用Bray-Curtis距離指數.

2 結果與分析

2.1 不同培養時間微生物群落的AWCD值

5種水樣微生物群落AWCD值隨培養時間的變化如圖1所示.

圖1 微生物群落AWCD值的變化曲線Fig.1 Change curve of AWCD value of microbial community

AWCD曲線在經過一定時間的延遲后迅速升高，進入指數增長期，隨著培養時間的延長趨于穩定.其中，WS1水樣最早進入穩定期，96 h后各時間點AWCD值沒有顯著差異.WS2、WS3和WS5水樣進入指數增長的時間比WS1水樣延遲，AWCD值趨于穩定的時間分別為168、168和120 h.WS4水樣AWCD值顯著低于其他水樣，在144 h后各時間點的AWCD值沒有顯著差異.

2.2 不同培養時間6類碳源利用情況

5種水樣72～192 h的碳源利用情況如圖2所示.由圖2可以看出，WS1水樣微生物群落對氨基酸類碳源的利用在96 h后沒有顯著差異，而其他各類碳源的利用在72 h后沒有顯著差異，即6類碳源在96 h后沒有顯著差異；WS2水樣微生物群落對碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類和胺類的利用沒有顯著差異的時間點分別為96、120、120、192、144、120 h，即6類碳源的利用在192 h后沒有顯著差異；WS3水樣微生物群落對6類碳源的利用沒有顯著差異的時間點分別為144、168、144、144、120、120 h，即6類碳源的利用在168 h后沒有顯著差異；WS4水樣微生物群落對6類碳源的利用沒有顯著差異的時間點分別為120、144、120、144、144、168 h，即6類碳源的利用在168 h后沒有顯著差異；WS5水樣微生物群落對6類碳源的利用沒有顯著差異的時間點分別為96、72、72、120、72、72 h，即6類碳源的利用在120 h后沒有顯著差異.

對比不同時間點水樣碳源利用的大小順序，發現144 h后WS1水樣碳源利用順序穩定為胺類＞羧酸類＞多聚物類＞碳水化合物類＞氨基酸類＞酚酸類；192 h后WS2水樣穩定為多聚物類＞氨基酸類＞酚酸類＞碳水化合物類＞羧酸類＞胺類；WS3、WS4和WS5水樣6類碳源的利用順序相同，分別在144 h、168 h和120 h穩定為多聚物類＞碳水化合物類＞羧酸類＞氨基酸類＞酚酸類＞羥酸類胺類.即除WS1水樣外其他4種水樣6類碳源的利用達到沒有顯著性差異之后，6類碳源的利用順序都趨于穩定.

圖2 不同培養時間下微生物群落的6類碳源利用情況Fig.2 Utilization of six grouped carbon sources by microbial communities at different incubation time

2.3 不同培養時間多樣性指數的變化

5種水樣72～192 h微生物群落的多樣性指數如表2所示.由表2可以看出，WS1水樣微生物群落的Shannon-Wiener指數、Pielou均勻度指數、Simpson指數、McIntosh指數和McIntosh均勻度分別在144、72、120、72、72 h后沒有顯著差異，即5個多樣性指數在144 h后沒有顯著差異；WS2水樣微生物群落的各項多樣性指數分別在144、96、120、96、96 h后沒有顯著差異，即5個多樣性指數在144 h后沒有顯著差異；WS3水樣微生物群落5個多樣性指數均在120 h后沒有顯著差異；WS4水樣微生物群落的5個多樣性指數分別在120、72、120、96、72 h后沒有顯著差異，即5個多樣性指數在120 h后沒有顯著差異；WS5水樣微生物群落除McIntosh指數在120 h后沒有顯著差異外，其他各項指數均在72 h后沒有顯著差異.

表2 不同培養時間下微生物群落的多樣性指數Tab.2 Diversity indices for microbial communities at different incubation time

2.4 不同培養時間水樣主成分的變化

對5種水樣不同培養時間的數據進行主成分分析，分析不同培養時間微生物群落底物利用特征的差異，結果如圖3所示.圖3中展示了每一水樣6個平行樣從72～192 h各時間點的排序情況，從圖3中可以看出每個樣品72 h、96 h的各點分布與120、144、168和192 h的各點分布距離較遠，反映出樣品微生物群落培養前期CSUP與培養后期差別較大.通過ANOSIM方法分析5種水樣微生物群落不同時間點CSUP的差異顯著性，結果發現5種水樣微生物群落的CSUP分別在96、120、144、120和96 h后沒有顯著差異，各水樣ANOSIM分析的R值和P值如表3所示.

圖3 水樣不同培養時間下微生物群落底物利用特征的主成分分析Fig.3 Community substrate utilization profile at different incubationtimebyprincipalcomponentanalysis（PCA）

表3 不同培養時間下微生物群落底物利用特征的ANOSIM分析Tab.3 ANOSIM analysis between CSUPs of microbial communities at different incubation time

2.5 不同時間點對5種水樣的區分

為了解不同時間點對5種水樣的區分情況，利用5種水樣在72～192 h的吸光度值數據進行主成分分析，結果如圖4所示.由圖4可以看出，72、96和120 h時間點5種水樣在第一和第二主成分上的距離和分布可見明顯變化，144、168和192 h時間點5種水樣在第一和第二主成分上的分布基本一致，說明144 h后微生物群落的底物利用特征趨于穩定.ANOSIM分析的R值和P值如表4所示.通過ANOSIM方法分析發現各時間點5種水樣微生物群的CSUP均存在顯著差異（P＜0.05），即各時間點數據均能區分5種水樣.對不同時間點5種水樣微生物群落的CSUP進行SIMPER相似度分析，結果如表5所示.由表5可以看出，在72～192 h內隨著培養時間的延長兩兩水樣之間的差異百分比逐步降低.

圖4 不同培養時間對5種水樣的區分Fig.4 Differentiation of the five water samples by different incubation time

表4 不同培養時間5種水樣兩兩比較的ANOSIM分析Tab.4 ANOSIM analysis of paired comparison between the five water samples at different incubation time

表5 不同培養時間5種水樣兩兩比較的SIMPER分析Tab.5 SIMPER analysis of paired comparison between the five water samples at different incubation time%

3 討論

在研究微生物多樣性時，由于環境樣品的復雜性，在利用Biolog Eco板分析時要選擇眾多參數包括AWCD值、6類碳源利用情況、多樣性指數及主成分分析等進行描述和比較不同樣品間的差異[30-31].本研究發現養殖水體微生物群落的上述指標達到沒有顯著差異的時間不同，其中WS1水樣AWCD值、6類碳源利用情況、多樣性指數及主成分分析達到沒有顯著差異的時間點分別為96、96、144和96 h；WS2水樣為168、192、144和120 h；WS3水樣為168、168、120和144 h；WS4水樣為144、168、120和120 h；WS5水樣為120、120、120和96 h.這是因為同一樣品各指標達到穩定的時間不同與各指標對時間的敏感度不同相關.AWCD作為顏色平均變化率反映的是Biolog Eco板的平均活性，AWCD值穩定后，各孔的顏色還可能不斷變化，因此各類碳源利用情況和多樣性指數還會發生變化.

本實驗中養殖水體微生物群落各功能指標達到穩定的時間不同，但是各時間點都在AWCD曲線的達到沒有顯著差異的時間點（即拐點）附近.其中除WS1水樣多樣性指數在拐點之后48 h，WS2和WS4水樣6類碳源的利用在拐點之后的24 h外，5種水樣其他各項指標達到穩定的時間都在拐點之前.說明當水樣AWCD曲線達到拐點時，微生物群落的各項代謝功能指標都趨于穩定.這與賈夏等[19]研究土壤樣品Biolog Eco板培養時間對分析結果的影響時的結論相一致.

本研究同時討論了不同時間點對5種水樣的區分，ANOSIM分析發現72～192 h各個時間點都可以很好地區分5種水樣，但是SIMPER分析表明水樣之間的差異程度隨培養時間的延長而降低.可能因為隨著培養時間的延長，Biolog Eco板上很多孔的顏色處于飽和，只能通過顯色較小或者沒有顏色變化的孔進行樣品的區分，所以導致水樣之間差異程度減小.如果要充分研究水樣微生物群落CLPP各相關指標，可以利用AWCD值達到沒有顯著差異的時間點進行分析，這時可以兼顧生長較慢的微生物，能夠全面地反映環境中的微生物群落[19].但建議不過多延長培養時間，因為隨著培養時間的延長存在平行樣品標準差增大和光孔反應飽和的問題[13].

如果為最大程度地區分樣品微生物群落CLPP各項指標的差異，可以選擇AWCD值指數增長期的時間點進行分析，此時可以較好地反映出環境樣品中生長較快的細菌種類.但是利用指數增長期數據進行分析，一般要求大致相同的接種密度[1].本實驗中WS1水樣在接入Biolog Eco板后快速進入指數增長期，而WS2～WS5水樣的指數增長較緩慢.目前養殖水體富營養化問題突出，池塘水樣成分復雜，養殖水體理化指標是否會對Biolog Eco板的顯色產生影響還有待于進一步研究.

綜上所述，養殖池塘水樣接入Biolog Eco板的培養時間對分析微生物群落的功能多樣性具有顯著影響，微生物群落的各項功能指標均在AWCD值達到沒有顯著差異的時間點趨于穩定.為了更好地區分樣品，可以選擇指數增長期的時間點，此時水樣之間的差異度高于穩定期.